フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性
Summary
本稿では、S.セレビシエ細胞とHEK293T細胞の両方でタンパク質自己集合を定量するFRETベースのフローサイトメトリープロトコルについて説明する。
Abstract
タンパク質の自己組立は、タンパク質機能を制御し、空間と時間の細胞プロセスを区分します。それを研究する現在の方法は、単一細胞分解能ではなく、低感度、間接的な読み出し、限られたスループット、および/または母集団レベルに苦しんでいます。分散型フルーロ性FRETまたはDAmFRETというこれらの制限に対処するフローサイトメトリーベースの単一方法論を設計しました。DAmFRETは、生体内で感知された発光FRETによってタンパク質自己アセンブリを検出および定量化し、酵母からヒト細胞に至るモデルシステム間での展開を可能にし、タンパク質に関係なく、感度の高い単一細胞、高スループットの読み出しを実現します。ローカリゼーションまたは溶解性。
Introduction
同質性タンパク質相互作用を研究するアッセイ、または「自己組織化」は、タンパク質のオリゴマー状態および溶解性が機能を決定するので重要である。プロテオームはホモマルチマー1、2、3、4が豊富ですが、比較的少数のタンパク質がモノマーとして機能します。タンパク質はまた、ストレス、年齢、または誤った調節のために異常に組み立てることができ、活動の病理学的変化につながります。このようなイベントを調節する要因、またはアセンブリの物理的性質を特定することは、多くの場合、非常に困難です。
タンパク質の数が増えるにつれて、異常な協調性と不確定な組織学で自己集合化が認められ、その結果、タンパク質密度の高い相として他の細胞成分からそれらの分解が起こり得ます。これらは、液滴やゲルなどの無秩序な凝縮物、またはアミロイド繊維などの高度に順序付けされたフィラメントの形態をとる。後者に関連する立体構造の変動は、その初期形成、または核形成を、分子レベル5、6で本質的に確率的にレンダリングする。核形成の確率は体積に合わせて拡大するので、このようなアセンブリの形成は、生細胞7、8の空間的限界において非常に確率的であり得る。確率的核系の限られた相分離の極端には、プリオン、自発的に核を作ることはめったにないが、一度形成されると、無期限に独自の成長をテンプレート化する高度に順序付けされたタンパク質アセンブリである。ASCと呼ばれるそのようなタンパク質の1つは、哺乳類の自然免疫細胞の活性においてデジタルプリオン様スイッチを実行する。ASC自己組織化は、病原体または危険関連分子パターンとの結合時にオリゴマー化された特定のタンパク質との相互作用によって核化される。ASCアセンブリは、自己組織化して活性化するためにプロカスパーゼ-1を自ら核化し、細胞9、10のサイトカイン成熟およびピロプトシスにつながる。その組み立てを担当するASCの領域は、人間のプロテオームの100人以上のメンバーで構成される死ドメインスーパーファミリーに属しています。生来の免疫とプログラムされた細胞死における死ドメインの重要な役割にもかかわらず、それらのほとんどは、自己組織化に関してまだ特徴付けられていない。このような挙動を伴う追加タンパク質の発見と特徴付けは、タンパク質自己組織化の直接的な単細胞読み出しによって大いに促進される。
サイズ排除クロマトグラフィーや超遠心分離などのタンパク質自己組織化を研究する古典的なタンパク質生化学のアプローチは、主に集団レベルの評価に限定されます。しかし、核化制限相遷移に起因する細胞間不均一性は、この詳細レベルではモデル化できません。蛍光顕微鏡に基づく単一細胞アプローチは、この能力を取り戻しますが、核生成を正確に定量化したり、まれなアセンブリを検出するために必要なスループットが欠けています。さらに、ほとんどの酵素やアミロイド前オリゴマーなどの可溶性自己アセンブリは、標準的な光顕微鏡では解決するには小さすぎて移動性が高すぎる。蛍光相関分光法などのより高度なアプローチによって検出できますが、細胞数とスループットは非常に限られています。
FRETやスプリット蛍眼補体などのタンパク質アセンブリの近接ベースのアッセイは、これらの問題に対する潜在的な解決策を提供します。しかし、それらは一般に、FRETの場合にはドナーおよびインセプター蛍煙管の相補タグに融合した目的のタンパク質を発現する2つの異なる構造体の使用を必要とする。これは実験のスループットを損なうし、またドナーおよび受入者の相対的なレベルの細胞間変動による感受性を低下させる。これを回避するために、我々は、単一の構造がドナーと受入者タグ付きタンパク質の両方を発現することを可能にする光変換性蛍光体質素子、mEos3.111を採用したアッセイを設計しました。未変換mEos3.1(GFP様ドナー)の発光スペクトルは、光変換されたmEos3.1(dsRed様インセプター)の励起スペクトルと十分に重なり合い、分子が近接しているときにFRETが発生することを可能にします(<10 nm)。したがって、405nm光の経験的に決定された用量に細胞をさらすことによって、総mEos3.1の最適な割合を受け入れ器の形態に変換し、我々は複数のサンプルにわたってドナーおよび受入器の一貫した、再現可能な相対レベルを達成し、表現レベル、および実験。561 nm光で直接励起した場合、または488nm光(すなわち感光放出FRET)で間接的に(ドナーからのエネルギー伝達によって)励起すると、受け入れ器蛍光を測定します。タンパク質集合をこれら2つの値の比率として報告し、フルーロリックFRETまたはAmFRETという用語を提供します。
フローサイトメトリーでタンパク質濃度を計算するために、まずmEos3.1でタグ付けされたSpc42の平均蛍光強度を計算します。酵母細胞にはSpc42の約1000分子が含まれているため、単一の蛍光緑色mEos3.1分子の蛍光強度を計算します。すべての細胞濃度で均一な光変換を利用することにより(図1E)、我々は、光変換後のすべてのアクセプタ強度の合計mEos3.1蛍光値を相関させる。その後、蛍光タンパク質のモルの総数を近似細胞質体積(イメージングフローサイトメトリーを用いて決定)で除算し、目的とするタンパク質の総細胞細胞濃度を得ることができる。正確な計算については、原稿8を参照してください。
酵母の2μプラスミドからmEos3.1融合タンパク質を発現させることにより、サンプル8毎に約千倍のタンパク質濃度をプローブします。我々は、トランスフェクション中のプラスミド取り込みの変動によりHEK293T細胞で同じことを達成し、したがって可変コピー数を達成する。
何千もの細胞に対するAmFRET(DAmFRET)の結果として得られた分布は、目的のタンパク質に対する細胞内の自己組織化の濃度依存性を明らかにする。全体的に、DAmFRETは、感度、スループット、再現性の前例のない組み合わせでタンパク質自己組立を発見し、特徴付けることを可能にする方法論を表します。
イメージングサイトメーターを用いることで、生体内タンパク質濃度測定を行うことができましたが、このようなサイトメーターは、ほとんどの研究機関ではまだ利用できません。それにもかかわらず、DAmFRETは典型的な非イメージングサイトメーターでも実行することができ、タンパク質発現の範囲にわたってタンパク質アセンブリの分布を得ることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
DAmFRETは生体内のタンパク質自己集合を検出する最も包括的な方法である。DAmFRETは、単一細胞分解能と高いスループットを持つ幅広い濃度で同質タンパク質タンパク質相互作用の直接読み出しを組み合わせたものです。DAmFRETの直接読み出しと融合タンパク質が特定の細胞内局在化または不溶性状態を必要としないという事実は、偽陽性を排除し、その適用性をネイティブ細胞下の場所で広範囲のタンパク質に拡張します。特に、T-サファイアやmCardinalなどのmEos3.1とスペクトル的に互換性のある蛍光体を持つオルガネラをタグ付けすることにより、可溶性および組み立てられたタンパク質の細胞内局在化をDAmFRETと共に決定することができます。
ここで説明するイメージングフローサイトメーターを用いて、ウェル当たり約20,000個のゲート状細胞を有する96ウェルプレートを分析するのに8時間かかります。しかし、我々はまた、はるかに高いスループット(毎分20サンプルまで)を達成する標準的な(非イメージング)細胞計でDAmFRETを定期的に実行します。実際には、空間的に分離された488と561 nmレーザーを持つフローサイトメーターは、ログアンプアーティファクトから解放され、ドナー、FRET、およびインセプタ信号を検出するための適切なPMTとフィルタを持っており、DAmFRETを実行するのに十分です。現在のところ、このスループットの向上は、ローカリゼーション情報と体積決定を犠牲にして、自己組織化を濃度ではなくタンパク質発現の関数として分析する必要があります。これは定性的分析の問題ではありません。さらに、発現がサイトソリック体積と密接に相関する内因性の「ハウスキーピング」タンパク質にスペクトル別の蛍光素を融合することにより、細胞質体積を推定することができる。
酵母細胞と哺乳動物細胞の両方にDAmFRETを導入した結果、DAmFRETは異なる発現系に容易に適応できます。これにより、タンパク質の自己組織化をネイティブの細胞コンテキストで研究することが可能になります。さらに、広く異なる細胞培養モデル間でタンパク質アセンブリを比較し、タンパク質の自己組織化を制御するメカニズムの保全を研究する機能を提供します。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ジェフ・ランゲ、ジェイ・アンルー、ジャンツェン・ウー、タリック・カーン、エレン・ケッターに、アッセイの開発に向けた取り組みに感謝します。この研究は、T.S.K.とA.R.Gの博士課程研究の要件の一部を、英国オープン大学、および米国のスタワーズ医学研究所大学院に登録した学生としての要件を満たすために行われました。追加のアッセイ関連情報は、https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016で見つけることができます。この原稿の根底にある元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372のスタワーズ元データリポジトリからアクセスできます。この作品は、NIHディレクターの早期独立賞DP5-OD009152、ダイムズ財団助成金第5-FY17-32のマーチ、およびスタワーズ医学研究所によって資金提供されました。
著者の投稿は以下の通りです。概念化:T.S.K.、S.V.、およびR.H.;方法論:T.S.K.、S.V.、A.R.G.、A.B;調査:S.V.、T.S.K.、A.R.G.正式な分析:S.V.、およびT.S.K.データキュレーション: T.S.K.ビジュアライゼーション:T.S.K、S.V.、ライティング(原案):S.V.、T.S.K.ライティング(レビュー、編集):R.H.、S.V.、およびT.S.K.資金調達取得:R.H.
Materials
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
Referencias
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