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Medicina

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Published: August 16, 2019
doi:
10.3791/59571
, ,
1Department of Cardiometabolic Disorders,Amgen Research and Discovery, Amgen Inc., 2Department of Translational Sciences,Amgen Research and Discovery, Amgen Inc.

Summary

Wir haben ein Protokoll optimiert, um murine Herzpericyten für die Grundlagenforschung und die Erforschung ihres biologischen und therapeutischen Potenzials zu isolieren und zu reinigen.

Abstract

Pericyte, perivaskuläre Zellen von Mikrogefäßen und Kapillaren, sind dafür bekannt, eine Rolle bei der Angiogenese, Gefäßstabilisierung und endothelialen Barriereintegrität zu spielen. Ihre gewebespezifischen Funktionen im Herzen sind jedoch nicht gut verstanden. Darüber hinaus gibt es derzeit kein Protokoll, das leicht zugängliche Materialien verwendet, um Pericyte kardialer Herkunft zu isolieren und zu reinigen. Unser Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung des weit verbreiteten Säugetiermodells, der Maus, als unsere Zellquelle. Mit der enzymatischen Verdauung und mechanischen Dissoziation des Herzgewebes erhielten wir eine rohe Zellmischung, die durch fluoreszaktivierende Zellsortierung (FACS) durch eine Vielzahl von Markern weiter gereinigt wurde. Da es keinen eindeutigen Marker für Pericyte gibt, haben wir für Zellen abgegrenzt, die CD31–CD34–CD45–CD140b+NG2+CD146+waren. Nach der Reinigung wurden diese Primärzellen kultiviert und mehrmals ohne Änderungen in morphologie und Markerexpression durchgesiet. Mit der Fähigkeit, regelmäßig primäre murine Herzpericyten mit unserem Protokoll zu erhalten, hoffen wir, die Rolle von Pericyten in der kardiovaskulären Physiologie und ihr therapeutisches Potenzial weiter zu verstehen.

Introduction

Perivaskuläre Zellen, die als Pericyten bekannt sind, umgeben die Mikrogefäße und Kapillaren des Gefäßbaums1,2. Physiologisch sind sie dafür bekannt, eine Rolle bei der Angiogenese zu fördern und zu spielen, die Barriereintegrität aufgrund ihrer engen Beziehung zu Endothelzellen zu erhöhen sowie die Gefäße1,2zu stabilisieren und zu reifen. Darüber hinaus sind die Funktionsstörungen und/oder der Verlust dieser Zellen in Krankheiten wie Alzheimer2,3 und verschiedene Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4 verwickelt. Diese Zellen sind im ganzen Körper zu finden, aber die Zellzahlen sind gewebeabhängig. Perizyten wurden vor allem im Gehirn aufgrund einer hohen Vaskularisation der Blut – Hirn-Schranke1,2untersucht. Im Herzen ist die Biologie der Pericyten jedoch unteruntersucht.

In letzter Zeit gibt es ein erhöhtes Interesse auf dem Gebiet für Herzperizyten, aber es gibt derzeit kein gestrafftes Protokoll für ihre Isolierung von einem der am häufigsten verwendeten Werkzeuge in der Biologie – der Maus. Es gibt Protokolle in der Literatur über die Isolierung von Pericyten aus dem Gehirn5, Netzhaut6, Plazenta7und Skelettmuskel8,9; Jedoch, wenige Protokolle sind auf die Isolierung pericytes aus dem Herzen. Es gibt mehrere Gruppen, die Herzperizyten isoliert haben. Nees et al. waren in der Lage, eine reichliche Menge an Herzperizyten von mehreren Arten einschließlich der Maus zu isolieren; jedoch, ihre Methoden verwendet spezifische in-house gebaute Ausrüstung, die Reproduzierbarkeit verringert10. Avolio et al.11, Chen et al.12, und Baily et al.13 auch erfolgreich isoliert Herzperizyten aus menschlichem Herzgewebe, aber menschlicheGewebe sind nicht immer verfügbar und schwer zu erhalten für einige Forscher. Hier haben wir eine Isolationsmethode entwickelt, um Herzperizyten aus Mausmodellen zu erhalten, damit Die Forscher ihre Biologie mit leicht verfügbaren Materialien weiter studieren können.

Mit enzymatischer Verdauung und Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) mit bekannten Schlüssel pericyte Marker14, unser Protokoll ermöglicht es uns, zu isolieren und zu reinigen eine Population von Pericyten, die durch CD31–CD34–CD45 gekennzeichnet sind– CD140b+NG2+CD146+. Unser Markerfeld enthält sowohl Einschluss- als auch Ausschlussmarker. CD45 wird als Marker verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen. CD31 wird als Marker verwendet, um Endothelzellen auszuschließen. CD34 wird als Marker verwendet, um sowohl hämatopoetische als auch endotheliale Vorläuferzellen auszuschließen. CD146 ist ein Marker für perivaskuläre Zellen. Schließlich sind NG2 und CD140b (auch bekannt als Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor Beta – PDGFR) beide zugelassene Marker für Pericyte14. Die erhaltene Primärkultur kann mehrfach kultiviert und durchdrungen werden, ohne dass sich die Morphologie oder der Markerausdruck ändert. Darüber hinaus können diese Zellen mit Endothelzellen kokultiviert werden, um ihre Wechselwirkungen zu untersuchen und miteinander zu sprechen. Diese Zellisolationsmethode wird es den Forschern ermöglichen, die Biologie und Pathophysiologie von Herzperizyten aus wildlebenden Typ-, Krankheits- und genetisch varianten Mausmodellen zu untersuchen.

Protocol

Alle Tiere wurden in einer Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditierten Einrichtung untergebracht und verwendet, und alle Tierarbeiten wurden unter angemessener tierärztlicher Aufsicht und unter dem Institutionellen Tier durchgeführt. Care and Use Committee (IACUC) genehmigtes Protokoll von Amgen Inc. 1. Vorbereitung von Werkzeugen und Kulturmedien Autoklav chirurgische 9 cm gerade Spitze Feinspitze Schere und 10 cm abgewinkelte gezackte Zange. 25 ml 5% fetales Rinderserum (FBS) und 5 ml 1% Penicillin Streptomycin (P/S) in eine 500 ml Flasche Calcium-Magnesium-freies Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (CMF-DPBS) geben. Legen Sie die Lösung in ein Eisbad, um sicherzustellen, dass es zum Zeitpunkt der Anwendung kalt ist. Aliquot 50 ml in ein 50 ml kegelförmiges Rohr zur Herzisolierung. Fügen Sie 250 Einheiten/ml Heparin-Natriumlösung in das 50 ml aliquot ein. Dies wird als heparinisierte CMF-DPBS bezeichnet. Fügen Sie 20% FBS (100 ml) und 1% P/S (5 ml) in eine 500 ml Flasche mit hohem Glukose-Dulbecco-modifiziertem Adlermedium (DMEM) hinzu. Dies wird als die enzymfreien Kulturmedien bezeichnet werden. Aliquot 20 ml DMEM + 20% FBS + 1% P/S und fügen Sie in 500 g/ml Kollagenase B. Dies wird als Enzymlösung bezeichnet. Halten Sie sowohl die enzymfreien Kulturmedien als auch die Enzymlösung bei 37 °C in einem Inkubator oder Wasserbad warm. 2. Vorbereitung von Tieren und Beschaffung von Herzgewebe Intraperitoneal injizieren Sie eine Maus mit 250 Einheiten Heparin-Natriumlösung mit einer 31 G Nadelspritze. Warten Sie dann 10 bis 15 min, während die Maus in ihrem Hauskäfig aktiv bleibt.HINWEIS: Repräsentative Daten in dieser Studie wurden von einer 4 Monate alten männlichen C57BL/6 Maus gewonnen. Dieses Protokoll kann jedoch auf jeder Maus verwendet werden, unabhängig von Belastung, Alter, Geschlecht, Gewicht usw. Anästhesisieren Sie die Maus mit 5% Isofluran. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe der Maus durch Pinch Reflex. Legen Sie die anästhesierte Maus in Supine-Position und band die Vorderbeine. Öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und können Sie die absteigende Aorta mit einer 25 G Schmetterlingsnadel anheben. Machen Sie einen Nick im rechten Atrium und durchdringen Sie das Herz mit mindestens 20 ml von 250 Einheiten/ml heparinisierte CMF-DPBS bei 2 ml/min mit einer variablen Durchfluss-Peristaltikpumpe. Wenn die PBS aus der rechten Vorrandzeit sauber kommt, ist die Durchblutung vollständig. Schneiden Sie das Herz an der Aorta aus und legen Sie es in das eiskalte CMF-DPBS. 3. Dissoziation von Herzgewebe Übertragen Sie das Herz in eine 15 cm x 15 cm Petrischale. Schneiden Sie das Herz in winzige Stücke (1 mm/Stück) mit Federschere und feinen Punktzangen mit genügend Enzymlösung, um die Stücke zu bedecken (10 x 15 ml). Die Teile und die Lösung in ein 50 ml konisches Rohr geben, mit Paraffin-Kunststofffolie versiegeln und bei 37 °C auf einem Orbital-Shaker bei 120 U/min für 75 min inkubieren. Nach der Kollagenase-Verdauung mit der Enzymlösung dekantiert die Flüssigkeit durch ein 100-m-Zellsieb in ein neues 50 ml-Rohr, aber lassen Sie genügend Lösung, um sicherzustellen, dass die Stücke nicht austrocknen. Mit feinen Punktzangen nehmen Sie das Gewebe aus dem Rohr und legen Sie ein paar Stücke auf ein Mikroskopschlitten. Dann schleifen Sie das Gewebe zwischen zwei Mikroskop-Dias, um das Gewebe aufzubrechen. Spülen Sie die Dias mit enzymfreien Kulturmedien in eine neue 50 ml konische Röhre. Wiederholen Sie Schritt 3.4, bis alle Gewebeteile getrennt sind. Kombinieren Sie die Lösungen von den Schritten 3.3-3.5 in einem Rohr. Die resultierende Suspension durch ein 100-m-Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Rohr abseihen. Zentrifuge bei 220 x g, 4 °C, für 5 min. Vorherige Lösung absaugen und Zellpellet in frischen enzymfreien Kulturmedien sanft wieder aufsetzen. Zählen Sie Zellen und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mithilfe eines Zellenzählers. Verdünnung der Zellen auf 1 x 106/ml mit kaltem FACS-Färbepuffer, der 500 ml DPBS und 10 bis 25 ml 2-5% Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Die Zellen sind bereit, gefärbt und sortiert zu werden. 4. Reinigung von Pericyten aus Rohzellmischungen mit FACS Vorbereiten und Beschriften von 5 ml FACS-Rohren für alle Steuerungen und Zellproben. Aliquot-Out-Zellen (1 ml Zellen pro Röhre) für eine ungefärbte Probe, Fluoreszenz minus eins (FMO) und isotypübereinstimmende Kontrollen. Verwenden Sie die verbleibenden Zellen für die Sortierung. Alle Bedienelemente und Proben können gleichzeitig vorbereitet und gebeizt werden.notiz:Insgesamt 13 ml bei 0,5 x 106Zellen/ml wurden für die repräsentative Sortierung von einem Herzen verwendet. Das Volumen hängt jedoch davon ab, wie viele Zellen der Forscher aus ihrer Isolation erhält, wie viele Herzen sie verwenden und wie gut das Herzgewebe verdaut wird; die Größe jedes Herzens ist auch eine Variable, die das Volumen ändern kann.Verwenden Sie Kompensationsperlen (Materialtabelle), um die Fluoreszenzkompensationskontrollen zu optimieren. Bereiten Sie eine Kompensationskontrolle für jedes Fluorchrom im Experiment in einem beschrifteten 5 ml FACS-Röhrchen vor. Für dieses Experiment bereiten Sie insgesamt 9 Kompensationskontrollen vor – 2 Arten von ungefärbten Perlen plus 7 verschiedene Fluorchrome aus dem Markerpanel, einschließlich NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 und Zelllebensfähigkeit-APC-Cy7 ( Materialtabelle). Fügen Sie einen Tropfen Kompensationsperlen (ca. 50 l) aus der Quetschdurchstechs zu jedem Rohr hinzu. Dann fügen Sie den Perlen 1 L Antikörper hinzu. Wiederholen Sie dies für jeden Antikörper aus dem Marker-Panel. Kräftig durch Pulswirbeln mischen. 30 min bei 4 °C vor Licht geschützt mit Ausnahme der Zelllebensfähigkeitsperlen, die bei Raumtemperatur vor Licht geschützt gelassen werden können. Als nächstes fügen Sie 3 ml FACS-Färbepuffer zu jedem Rohr und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C hinzu. Aspirieren Sie die Lösung und setzen Sie jedes Perlenpellet in 400 l FACS-Färbepuffer wieder aus. Die Kompensationskontrollen können verwendet werden. Auf Eis bleiben. Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um die Hintergrundfärbung aufgrund von Spektralüberlappungen zu optimieren. Bereiten Sie FMO-Kontrollen vor, indem Sie 1 ml Zellen verwenden, die aus Abschnitt 4.1 in einem 5 ml FACS-Rohr alizitiert wurden, und alle Antikörper aus dem in Schritt 4.1.1 beschriebenen Markerpanel bei einer Verdünnung von 1:100 hinzufügen, jedoch einen Antikörper ausschließen. Erstellen Sie beispielsweise einen NG2-AF488 FMO, indem Sie Antikörper für CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, Zelllebensfähigkeitsfarbstoff, aber nicht den NG2-AF488-Antikörper, einbeziehen. Mischen Sie sanft durch Pulswirbelung. Wiederholen Sie dies für jeden Antikörper für insgesamt 7 Kontrollen. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Als nächstes fügen Sie 3 ml FACS-Färbepuffer zu jedem Rohr und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C hinzu. Apirieren Sie die Lösung ab und setzen Sie jedes Zellpellet in 400 l FACS-Färbepuffer wieder auf. Die FMO-Steuerungen können verwendet werden. Auf Eis bleiben. Verwenden Sie isotypübereinstimmende Kontrollantikörper (Materialtabelle) für unspezifische Färbung. Bereiten Sie Isotypkontrollen vor, indem Sie den isotypgerechten Kontrollantikörper (Materialtabelle) zu 1 ml Zellprobe hinzufügen, die aus Abschnitt 4.1 bei einer Verdünnung von 1:100 in einem 5 ml FACS-Rohr hergestellt werden. Mischen Sie sanft durch Pulswirbelung. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Als nächstes fügen Sie 3 ml FACS-Färbepuffer zu jedem Rohr und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C hinzu. Apirieren Sie die Lösung ab und setzen Sie jedes Zellpellet in 400 l FACS-Färbepuffer wieder auf. Die Isotype-Steuerelemente können verwendet werden. Auf Eis bleiben. Bereiten Sie Zellen vor, die sortiert werden sollen, indem Sie frisch isolierten Zellen einen Antikörpercocktail hinzufügen. Bereiten Sie die Zellprobe aus Abschnitt 4.1 vor, indem Sie einen Antikörpercocktail mit Anti-Maus-NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 bei jeweils 1:100 Verdünnung und Zelllebensfähigkeitsfarbstoff bei 1:1.000 Verdünnung hinzufügen. Sanft Wirbel zu mischen. Inkubieren Sie Proben bei 4 °C für 30 min vor Licht geschützt. Nach der Färbung Zellen mit FACS-Färbepuffer durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min 4 °C waschen. Absauglösung absaugen und das Zellpellet im FACS-Färbepuffer auf 0,5 x 106 Zellen/ml aussetzen. Mit neuen FACS-Rohren, die 35 m Filtertops, Pipetten-gebeizte Zellproben auf die Deckel und Schwerkraftfiltrat haben, um einzellige Suspensionen zu erhalten. Auf Eis bleiben. Verwenden Sie einen Zellsortierer, um Zellen zu reinigen. Führen Sie die ungefärbten Zellen auf dem Zellsortierer aus, um Spannungen einzustellen und das Hintergrundsignal zu korrigieren (z. B. Spannungen für vorwärts gestreut auf 490-560 und für die Seitenstreuung auf 180-250). Führen Sie jede einfarbige Kompensationsperlenprobe einzeln aus, um die Spannungen für jeden Kanal anzupassen und die Tore für das positive Signal anzupassen. Sammeln Sie Daten. Verwenden Sie die Software, um die Spektralüberlappung zu berechnen, indem Sie die Kompensationsmatrix berechnen. Alle Spannungen sind bereit und eingestellt. Führen Sie jedes Isotype-Steuerelement nacheinander aus, und diese Daten können verwendet werden, um Gates für unspezifische Bindungen anzupassen, falls vorhanden. Führen Sie jede FMO-Probe nacheinander aus und passen Sie die Spannungen für jeden Kanal an, um die Spektralblutung durch ein mehrfarbiges Panel zu korrigieren. Führen Sie die gebeizten Zellproben im Zellsortierer aus und sammeln Sie Zellen in 10 ml enzymfreien Kulturmedien (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) in einem 15 ml konischen Sammelrohr. Verwenden Sie die folgende Gating-Strategie: Gate für einzelne Zellen, Gate für lebende Zellen, Gate für CD45-Negativzellen, Gate für CD34- und CD31-Negativzellen, Gate für NG2-positive Zellen und schließlich Gate für CD146- und CD140b-positive Zellen. 5. Kultivierung von Pericytes Eine 24-Well-Platte mit 0,2% Gelatine für 5 min beschichten und Gelatinelösung absaugen. Samen frisch gewonnene Zellen aus Schritt 4.2.5 in DMEM + 20% FBS + 1% P/S bis zu 2 x 104 Zellen/cm2. Kulturzellen in einem Zellinkubator auf 37 °C, 5%CO2 und 95% O2 eingestellt. Passierung von Pericyten Sobald die Zellen zu 95 % konfluent sind, waschen Sie Zellen mit warmen 1x DPBS und heben Sie Zellen mit 200 l 0,1% Trypsin in jedem Brunnen bei Raumtemperatur von 3 bis 5 min. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen. Neutralisieren Sie das Trypsin mit dem 3,5-fachen der Menge an Kulturmedien (700 l DMEM + 20% FBS + 1% P/S) und Samendurchgang zwei (P2) Zellen auf eine unbeschichtete 6-Well-Platte bei 2 x 104 Zellen/cm2. Jeder Brunnen, wenn er konfluent ist, kann in einen einzelnen T-75-Kolben als P3-Zellen verschoben werden, der dann im Verhältnis 1:6 geteilt werden kann. 6. Charakterisierung von Pericytes Durchflusszytometrie-Analyse Verwenden Sie dasselbe FACS-Färbeprotokoll und dieselbe Gating-Strategie wie zuvor in Abschnitt 4 beschrieben. Führen Sie Steuerelemente und gebeizte Proben auf dem Durchflusszytometer aus. Sammeln von Daten und Analysieren von Daten mit der Analysesoftware (Tabelle der Materialien). Um Hellfeldbilder zu sammeln, wachsen Zellen in einem Kolben in einem Zellinkubator, der auf 37 °C, 5% CO2 und 95% O2eingestellt ist. Erfassen Sie Bilder auf einem Mikroskop, nachdem Zellen an der Oberfläche befestigt wurden. Immunzytochemie Wachsen Sie Zellen in einer 96-Well-Platte bis 90% konfluent. Zellen mit warmen 1x DPBS waschen und mit 4% Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie Zellen 3x mit 1x DPBS und permeabilisieren Sie mit 0,1% Waschmittel für 10 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Zellen mit Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur. Nach der Blockierung primäre Antikörper (ein Antikörper pro Brunnen) verdünnt 1:100 im Sperrpuffer hinzufügen und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Primäre Antikörper sind: Anti-NG2, Anti-CD140b, Anti-CD31, Anti-Vimentin, Anti-Desmin, und Anti-Alpha glatten Muskel Aktin. Am nächsten Tag, Waschzellen 3x mit Waschpuffer (Tabelle der Materialien). Sekundärer Antikörper 1:1.000 in Blockierpuffer geben und 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln brüten. Sekundärer Antikörper ist ein Anti-Kaninchen konjugiert zu FITC. Waschzellen 3x mit Waschpuffer. Fügen Sie 300 m Kernfleck bei 1:1.000 für 5 min bei Raumtemperatur verdünnt. Waschen Sie Zellen 3x mit 1x DPBS und montieren Sie mit Montagemedien. Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop.

Representative Results

Nach enzymatischer Verdauung und Dissoziation des ganzen Herzens und vor der FACS-Reinigung der Zellen sind Zellen eine rohe Mischung, die viele verschiedene Zelltypen aus dem Herzen enthält (Abbildung 1A). Nach FACS-Reinigung und Kultivierung sind die Zellen homogen. Sie sind einzeln nukleiert, ziemlich flach und haben die typische pericyte rhomboidMorphologie (Abbildung 1B). Mit FACS werden Zellen auf Homogenität gereinigt. Die ungefleckte Kontrollzellenprobe wird verwendet, um die Gating-Strategie zu zeigen (Abbildung 2). Zuerst wurden Trümmer und Doublets basierend auf vorwärts- und seitlichen Streuverteilungen abgegrenzt. Dann wurden tote Zellen aufgrund ihrer Aminreaktion mit dem Farbstoff, der ein Signal erzeugt, das größer und intensiver als lebende Zellen ist, ausgesperrt. Von den lebenden Zellen wurden hämatopoetische Zellen durch CD45+abgezäut. Um hämatopoetische und endotheliale Zellen weiter zu entfernen, wurden CD34+ und CD31+ Zellen ausgegrenzt. Schließlich wurden NG2+ und CD140b+/CD146+ Zellen als perivaskuläre Zellen mit Expression typischer Pericytmarker ausgewählt (Abbildung 3). Das Markerpanel wurde auch an Mauskoronar-Endothelzellen als Kontrolle getestet (Supplemental Abbildung 1). Nur etwa 1% der Rohzellmischung bestand nach der Sortierung aus Pericyten. Um zu bestätigen, dass die Zellen tatsächlich Pericyten waren, haben wir die Zellen zur weiteren Charakterisierung durchgekreuzt. Die Zellen wuchsen schnell, sobald sie P3 in den T-75-Flaschen erreichten, ohne dass sich die Lebensfähigkeit im Alter veränderte (Zusatzabbildung 2). Im Vergleich zu den Pericyten des menschlichen Gehirns hatten die Zellen eine ähnliche Morphologie (Abbildung 4A). Im Vergleich zu Maus- und menschlichen glatten Muskelzellen hatten die Zellen eine andere Morphologie (Abbildung 4A). Es gab auch keine beobachteten Veränderungen in der Morphologie oder Markerexpression bei P7, wenn immunostainiert oder durch Durchflusszytometrie-Analyse nach Passaging (Abbildung 4B,C). Abbildung 1 : Rohzellen im Vergleich zu gereinigten Zellen. (A) Das hellfeldige Bild der rohen Zellmischung poste die herz-enzymatische Verdauung und Dissoziation, die 14 Tage lang in einem T25-Kolben kultiviert wurde. (B) Das Hellfeldbild einer homogenen Population von Herzperizyten nach der Sortierung und Kultivierung nach 14 Tagen. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Repräsentative Bilder der FACS-Analyse von nicht befleckten Zellen. Schematische Darstellung der Gating-Strategie zur Reinigung der Rohzellmischung. Gate für Zellen, die einzeln, live, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+und CD140b+sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3 : Repräsentative Bilder der FACS-Analyse von Rohzellen. Schematische Darstellung der Sortierung, die verwendet wird, um eine homogene Population von Herzperizyten zu erhalten. Ungefähr 1% der Rohzellen sind CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4 : Charakterisierung primär isolierter Herzperizyten (A) Hellfeldbilder von kultivierten Zellen aus dem menschlichen Gehirn (hPC) und Mausherzen (mPC) zeigen eine ähnliche Perizytenzellmorphologie, aber eine andere Morphologie von menschlichen glatten Muskelzellen hSMC) und Maus glatte Muskelzellen (mSMC). Skala bar = 100 m. (B) Phenotypische Charakterisierung von Zellen bei P7 durch Immunzytochemie für Pericytenmarker. Skala bar = 100 m. (C) Analyse durch Durchflusszytometrie der Pericyten bei P7, wo sie für negative Marker CD31, CD34, CD45 und positive Marker NG2, CD140b und CD146 eingezäunt wurden. Die Bevölkerung bleibt homogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder der Durchflusszytometrieanalyse von Endothelzellen mit Markerpanel. Eine Maus koronare Endothelzelllinie wurde als Steuerung für die Bindungsspezifität für die Marker verwendet. Mit der gleichen Gating-Strategie, die in der Sortierung verwendet wurde, mit Ausnahme eines positiven Gates für CD31 anstelle eines negativen Gates, waren die Endothelzellen negativ für CD45, CD34, NG2, CD140b und CD146, aber positiv für CD31 wie erwartet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Durchflusszytometrieanalyse verschiedener Passagen von mPC. Primäre isolierte Herzperizyten wurden kultiviert und bis zu Durchgang 12 durchgesiepft. Die Zellen wurden mit Propidiumjodid befleckt und auf einem Durchflusszytometer analysiert. Die Kontrollpopulation ist eine Mischung aus abgestorbenen und lebenden Zellen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der lebensfähigen Zellen zwischen den Passagen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Discussion

Da Studien über Herzpericyten relativ neu sind, muss die Rolle von Pericyten in der kardiovaskulären Physiologie und Pathophysiologie noch definiert werden. In anderen Organen haben sie eine Schlüsselrolle bei der Gefäßhomöostase und Perfusion1,2gespielt. Im Vergleich zur Literatur von Pericyten aus anderen Organen wie dem Gehirn gibt es deutlich weniger Veröffentlichungen über Herzperizyten. Die Isolierung von Herzperizyten ist entscheidend für das Verständnis ihrer funktionellen Eigenschaften und Signalmechanismen. Daher wird dieses Protokoll den Forschern eine einfachere Möglichkeit bieten, aus einer leichter verfügbaren Gewebequelle auf Herzperizyten zuzugreifen und Studien über ihre Biologie zu fördern. Es wird helfen, Fragen zu beantworten, wie Herzperizyten zur Herzhomöostase und Pathophysiologie beitragen, sowie ihr therapeutisches Potenzial zu untersuchen.

Die Perytpopulation, die aus dem murinen Herzen isoliert und durch CD31–CD34–CD45–CD140b+NG2+CD146+ gekennzeichnet ist, wurde mehrfach durchforsst (bis zu P12 und war immer noch stark), was nicht Verringerung der Rentabilität und vermehren sich schnell (Zusatzabbildung 2). Die Zellen wurden auch kryogefroren und mit mindestens 95% Lebensfähigkeit zurückgewonnen. Wir bevorzugen jedoch die Verwendung von Zellen P7 oder jünger für unsere Experimente. Vergleicht man Hellfeldbilder unserer Pericyten mit pericyten des menschlichen Gehirns, so haben die beiden Zelllinien eine vergleichbare Zellmorphologie (Abbildung 4A), während sie sich in der Morphologie von glatten Muskelzellen unterscheiden (Abbildung 4A). Unsere P7-Zellen waren durch Immunzytochemie für Pericytenmarker gekennzeichnet, einige von unserem FACS-Panel (NG2 und CD140b), und einige nicht im Panel (Vimentin, Desmin, SMA) und wir fanden heraus, dass die Zellen Pericytmarker homogen exprimierten (Abbildung4B). Zusätzlich wurden unsere P7-Zellen durch Durchflusszytometrie erneut mit demselben Markerpanel analysiert, um Änderungen der Markerexpression aufgrund von Passaging zu bewerten, und wir stellten fest, dass es keine Änderungen gab (Abbildung 4C). Daher sind unsere Zellen sowohl phänotypisch als auch morphologisch Pericyten.

Die Studien von Nees et al.10, Avolio et al.11, Chen et al.12und Baily et al.13 haben erfolgreiche Herzperizytenisolationen gezeigt. Die Verwendung einer eigens angefertigten Ausrüstung zur Ablösung der Pericyten von den Mikrogefäßen durch Nees et al.10 umfasste jedoch zwei Kammern mit Pumpen, die die Proteaselösung durch einen Netzstapel hin und her durchdrangen, was schwer zu replizieren war, da sie sich als kein Schema und/oder Bild des Geräts und seiner Bauweise. Obwohl Nees et al.10 erfolgreich Herzperizyten von vielen Arten isolierten, waren wir nie in der Lage, ihre Methode zu reproduzieren. Unser Pericyt-Ablösungsschritt in unserem Protokoll verwendet einfach einen Orbital-Shaker (um alle Zellen zu dissoziieren), der in den meisten, wenn nicht allen Laboratorien verfügbar ist, mit der Gewebe- und Enzymlösung in einem konischen Rohr gefolgt von einem mechanischen Dissoziationsschritt. Es ist kein kundenspezifisches Gerät erforderlich. Zweitens betreffen die übrigen Protokolle die Verwendung von menschlichem Gewebe, und daher beschränkt sich die Beschaffung von menschlichem Gewebe auf die Forscher. Unser Protokoll ist eine Modifikation und Optimierung der aktuellen Protokolle9,12 mit Mausmodellen (Wildtyp, genetisch verändert, krank) und Materialien, die allen Forschern zur Verfügung stehen.

Da perivaskuläre Zellen im Allgemeinen empfindlich sind, ist die Lebensfähigkeit der Zellen entscheidend, um eine gute Ausbeute zu erzielen. Bei der Beschaffung von Herzgewebe und der Färbung von Zellen müssen das Gewebe/die Zellen eiskalt gehalten werden. Zweitens kann die enzymatische Verdauung des Gewebes individuell optimiert werden müssen. Je nach Aktivitätseinheiten auf den Fläschchen von Enzymen müssen Die Konzentration und Verdauungszeit möglicherweise optimiert werden. Stellen Sie sicher, dass die enzymatische Lösung jedes Mal frisch zubereitet wird, wenn sonst der Ertrag abnimmt. Drittens enthält die Rohmischung viele Zellen, einige tote und/oder sterbende, es ist am besten, die Konzentration von FBS im Färbepuffer von 5% auf 2% zu senken. Wenn Sie Probleme mit Zellen haben, die die Düse während der Sortierung verstopfen, bereichern Sie die Zellen zuerst mit einem Totenzellentfernungskit. Sie können der Zellvorsortierung auch EINEN EDTA/HEPES-Puffer oder eine DNase-Behandlung hinzufügen, um Zellverklumpung zu verhindern. Da unser Antikörperpanel ziemlich groß ist und viele Fluorophore verwendet, stellen Sie sicher, dass Ihre FMO-Kontrollen und Kompensationskontrollen korrekt durchgeführt werden.

Eine Einschränkung dieser Methode ist die Menge an Herzperizyten, die pro Herz erhalten werden kann. In unserem Fall waren nur 1,1% unserer Rohmischung aus einem Mausherz Pericyten, was mit dem Prozentsatz in den menschlichen Herzisolationen vergleichbar ist, aber die Anzahl der Zellen ist aufgrund der Menge an Herzgewebe, die eine Maus bietet, deutlich geringer. Da die Startzahl der Zellen nach FACS so niedrig ist, wäre es besser, sich von mehreren Herzen gleichzeitig zu isolieren. Das Problem dabei ist jedoch die schiere Anzahl von Zellen, die Sie an einem Tag sortieren müssen. Wenn Sie mehr als 30 Millionen Zellen haben, wird es schwierig sein, durch die Art zu bekommen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Wenn der Ermittler mehrere Zellsortierer hätte, wäre es sinnvoll, mehrere Herzen an einem Tag zu isolieren. Eine andere Einschränkung ist, dass, weil wir nicht wissen, ob es Subpopulationen von Pericyten im Herzen wie es Skelettmuskel15,16, wir nicht wissen, ob wir einen Subtyp in unserer Gating-Strategie beseitigen. Wir sind dabei, unsere Herzperizyten zu charakterisieren und sind bisher in unseren unveröffentlichten Daten funktional wie andere Pericyten in der Literatur.

Unser Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, Fragen zu Herzperizyteneigenschaften, Eigenschaften, Funktionalität und anderen Aspekten zu beantworten, die dazu beitragen, ihren Beitrag zur Herzhomöostase und Hämodynamik zu definieren. Diese Zellen könnten therapeutisches Potenzial für Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben, sobald ihre Biologie besser verstanden wird.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken dem Amgen Flow Cytometry Core für ihre Hilfe beim Fluorophor-Panel-Design, der Fehlerbehebung und der Zellsortierung.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Corning 25-053-Cl dilute with 1x DPBS to get 0.1%
100 μM Cell strainer FisherSci 22363549
15 mL Falcon conical tubes BD 352096
24-well plate Corning CLS3527
25 gauge butterfly needle FisherSci 22-253-146
31 gauge needle syringe FisherSci B328446
50 mL Falcon conical tubes BD 352098
6-well plate Corning CLS3516
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb abcam ab32575 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD140b rabbit mAb Cell Signaling 28E1 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-CD31 rabbit pAb abcam ab28364 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-desmin rabbit pAb abcam ab8592 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-NG2 conjugated to AF488 Millipore MAB5384A4 Antibody used in ICC 1:100 dilution
anti-vimentin rabbit mAb abcam ab92547 Antibody used in ICC 1:100 dilution
ArC Amine Reactive Compensation bead kit Invitrogen A10346 compensation beads for Live/Dead Near IR dye
Brightfield Microscope camera attached
CD140b-PE (clone APB5) eBioscience 12-1402-81 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD146-BV605 (clone ME-9F1) BD 740434 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD31-APC (clone MEC 13.3) BD 551262 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD34-BV421 (clone RAM 34) BD 56268 Antibody used in FACS 1:100 dilution
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) BD 552848 Antibody used in FACS 1:100 dilution
Centrifuge eppendorf
Collagenase B Roche 11088815001 0.226 U/mg lyo.
Confocal Microscope
DAPI ThermoFisher D1306 nuclear stain
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV 500 mL
Dowell scissors FST 15040-11
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Corning 21-030-CV 500 mL
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) Corning 21-031-CV 500 mL
Dumont #5 Fine Forceps FST 11254-20
FACSAria cell sorter BD Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
FACSAria software BD
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL BD 38057
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL BD 08-771-23
Fetal Bovine Serum Corning 35-015-CV 500 mL
Fine scissors FST 14060-09
FlowJo software FlowJo LLC
Fortessa LSR flow cytometer BD Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW
Gelatin-based coating Cell Biologics 6950
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 Antibody used in ICC 1:1000 dilution
Graefe Forceps FST 11049-10
Heparin sodium solution Hospira NDC 0409-2720-02 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines
Incubator set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 
Live/Dead-Near IR Life Technologies L10119
Microscope slides FisherSci 12-550-343
NG2-FITC Millipore AB5320A4 Antibody used in FACS 1:100 dilution
Oribital shaker VWR Inside 37 °C incubator or room
Paraformaldehyde FisherSci 50-980-487 dilute with 1x DPBS to get 4%
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
 Petri dish FisherSci FB0875714
Pipette and tips
ProLong Diamond ThermoFisher P36965 mounting media
Propidum Iodide ThermoFisher cell viability dye for supplemental figure 2
Rabbit IgG FITC eBiosciences 11-4614-80 Isotype control antibody – FITC
Rat IgG2a APC Biolegend 400512 Isotype control antibody – APC
Rat IgG2a BV421 Biolegend 400536 Isotype control antibody – BV421
Rat IgG2a BV605 BD 563144 Isotype control antibody – BV605
Rat IgG2a PE Biolegend 400308 Isotype control antibody – PE
Rat IgG2b PE-Cy7 Biolegend 400617 Isotype control antibody – PE-Cy7
SuperBlock ThermoFisher 37515 blocking buffer
T75 ThermoFisher 156499
Triton X-100 Sigma X100 detergent, dilute with x DPBS to get 0.1%
UltraComp beads Invitrogen 01-2222-42 compensation beads
Variable-Flow Peristaltic Pump FisherSci 13-876-1
ViCell Cell counter Beckman
Wash buffer 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS
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Referencias

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Lee, L. L., Khakoo, A. Y., Chintalgattu, V. Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes. J. Vis. Exp. (150), e59571, doi:10.3791/59571 (2019).
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