Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Tüm hayvanlar, Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası (AAALAC) akredite tesisi Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği’nde barındırılan ve kullanılan ve tüm hayvan çalışmaları uygun veteriner gözetimi altında ve Kurumsal Hayvan altında yapılmıştır Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Amgen A.Ş. protokolünü onayladı. 1. Araç ve Kültür Medyasının Hazırlanması Otoklav cerrahi 9 cm düz ucu ince nokta makası ve 10 cm açılı tırtıklı forceps. 500 mL kalsiyum magnezyum içermeyen Dulbecco’nun fosfat-tamponlu salinine (CMF-DPBS) 25 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL %1 penisilin streptomisin (P/S) ekleyin. Kullanım sırasında soğuk olmasını sağlamak için çözeltiyi bir buz banyosuna yerleştirin. Aliquot 50 mL kalp izolasyonu için 50 mL konik tüp içine. 50 mL aliquot içine 250 adet/mL heparin sodyum çözeltisi ekleyin. Buna heparinize CMF-DPBS olarak anılacaktır. 500 mL’lik yüksek glikozlu Dulbecco’nun modifiye kartal ortamına (DMEM) FBS (100 mL) ve %1 P/S (5 mL) ekleyin. Bu enzimsiz kültür medya olarak anılacaktır. Aliquot 20 mL DMEM + FBS + %1 P/S ve kollajenaz B 500 μg/mL ekleyin. Bu enzim çözeltisi olarak anılacaktır. Hem enzimiçermeyen kültür ortamını hem de enzim çözeltisini 37 °C’de bir kuvözde veya su banyosunda sıcak tutun. 2. Hayvan Ve Kardiyak Doku Temini Hazırlanması İntraperitoneally 31 G iğne şırınga ile 250 adet heparin sodyum çözeltisi ile bir fare enjekte. Ardından fare ev kafesinde aktif kalırken 10−15 dk bekleyin.NOT: Bu çalışmada 4 aylık erkek C57BL/6 fareden elde edilen temsili veriler elde edilebildi. Ancak, bu protokol ne olursa olsun gerginlik, yaş, cinsiyet, ağırlık, vb herhangi bir fare üzerinde kullanılabilir. % 5 izoflurane ile fare anestezik. Çimdik refleksi ile farenin anestezi derinliğini kontrol edin. Anestezili fareyi supine pozisyonunda yerleştirin ve ön ayaklarını bantlayın. Göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve 25 G kelebek iğnesi kullanarak alçalan aortu kanüle edin. Sağ atriyumda bir çentik yapın ve 2 mL/dk’da en az 20 mL 250 birim/mL heparinize CMF-DPBS ile kalbe değişken akışlı peristaltik pompa saptan. PBS sağ atria temiz çıktığında, perfüzyon tamamlanır. Kalbi aorttan kesin ve buz gibi CMF-DPBS’ye yerleştirin. 3. Kalp Dokusunun Dissociasyonu Kalbi 15 cm x 15 cm Petri kabına aktarın. Kalbi, yay makası ve ince nokta forsepslerini kullanarak parçaları (10−15 mL) kaplayacak kadar enzim çözeltisi kullanarak küçük parçalara (1 mm/adet) kesin. Parçaları ve çözeltiyi 50 mL konik bir tüpe aktarın, parafin plastik filmle mühürleyin ve 37 °C’de 120 rpm’de 75 dakika boyunca bir orbital shaker’da kuluçkaya yatırın. Enzim çözeltisi ile kollajenaz sindirim sonra, yeni bir 50 mL tüp içine 100 μm hücresüz ile sıvı decant ama parçaları kurumasını sağlamak için yeterli çözüm bırakın. İnce nokta forceps kullanarak, tüp ten doku çıkarmak ve bir mikroskop slayt üzerine birkaç parça yerleştirin. Sonra iki mikroskop slaytlar arasında doku kırmak için doku eziyet. Yeni bir 50 mL konik tüp içine enzimsiz kültür medya ile slaytlar durulayın. Tüm doku parçaları ayrıştırılıncaya kadar adım 3.4 tekrarlayın. 3.3−3.5 adımlarından gelen çözümleri tek bir tüpte birleştirin. Ortaya çıkan süspansiyonu 100 m hücreli süzgeçten yeni bir 50 mL konik tüpe zorlayın. Santrifüj 220 x g, 4 °C, 5 dk. Önceki çözelti kapalı aspire ve taze enzimiçermeyen kültür medya hücre pelet yavaşça askıya. Hücreleri sayın ve hücre sayacı kullanarak canlılığı kontrol edin. 500 mL DPBS ve 10−25 mL 2−5% büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) içeren soğuk FACS boyama tamponu ile hücreleri 1 x 10 6/mL’ye seyreltin. Hücreler lekelenmeye ve sıraya girmeye hazırdır. 4. Facs kullanarak Ham Hücre Karışımından Perisitar Tüm kontroller ve hücre örnekleri için 5 mL FACS tüpleri hazırlayın ve etiketleyin. Lekesiz bir örnek için hücreleri (tüp başına 1 mL) aliquot, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri ve isotip uyumlu kontroller için. Sıralama için kalan hücreleri kullanın. Tüm kontroller ve numuneler aynı anda hazırlanabilir ve elde edilebilir.Not:0,5 x 10’da toplam 13 mL6hücreleri/mL’si tek kalpten temsili sıralama için kullanılmıştır. Ancak, hacim araştırmacı onların izolasyon elde kaç hücre bağlıdır, kaç kalp kullanmak, ve ne kadar iyi kalp dokusu sindirilir; her kalbin boyutu da hacmi ni değiştirebilecek bir değişkendir.Floresan telafikontrollerini optimize etmek için tazminat boncukları (Malzeme Tablosu) kullanın. 5 mL FACS etiketli bir tüpte deneydeki her florokrom için bir telafi kontrolü hazırlayın. Bu deney için toplam 9 telafi kontrolü hazırlayın — 2 çeşit lekesiz boncuk artı NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 ve hücre canlılığı-APC-Cy7 dahil olmak üzere işaret panelinden 7 farklı florokrom ( Malzeme Tablosu). Sıkma şişesinden her tüpe bir damla tazminat boncukları (~ 50°L) ekleyin. Daha sonra boncuklara 1 μL antikor ekleyin. Marker panelinden her antikor için tekrarlayın. Darbe girdapları ile şiddetle karıştırın. Oda sıcaklığında ışıktan korunan hücre canlılığı boncukları dışında 4 °C’de 30 dakika boyunca ışıktan korunur. Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her boncuk peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Telafi denetimleri kullanıma hazırdır. Buzda kal. Spektral çakışma nedeniyle arka plan boyama optimize etmek için FMO kontrolleri kullanın. 5 mL FACS tüpünde bölüm 4.1’den alınan 1 mL hücre yi kullanarak ve 1:100 seyreltmede adım 4.1.1’de tanımlanan marker panelinden tüm antikorları ekleyerek ancak bir antikor hariç olmak üzere FMO kontrollerini hazırlayın. Örneğin, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, hücre canlılığı boya sıcabilir boya değil, NG2-AF488 antikor için antikorlar ekleyerek bir NG2-AF488 FMO hazırlayın. Darbe girdap tarafından yavaşça karıştırın. Her antikor için toplam 7 kontrol için tekrarlayın. 4 °C’de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka. Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her hücre peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. FMO kontrolleri kullanıma hazırdır. Buzda kal. Nonspesifik boyama için isotipuyumlu kontrol antikorları (Malzeme Tablosu) kullanın. Her biri 5 mL FACS tüpte 1:100 seyreltme de bölüm 4.1’den hazırlanan hücre örneğinin 1 mL’sine isotip uyumlu kontrol antikoru (MalzemeTablosu)ekleyerek isotip kontrolleri hazırlayın. Darbe girdap tarafından yavaşça karıştırın. 4 °C’de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka. Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her hücre peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Isotip denetimleri kullanıma hazırdır. Buzda kal. Taze izole hücrelere antikor kokteylekleyerek sıralanacak hücreleri hazırlayın. Bölüm 4.1’den hücre örneğini fare karşıtı NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7’yi 1:100 seyreltme de ve hücre canlılığını 1:100 000 seyreltme de içeren bir antikor kokteyline ekleyerek hazırlayın. Yavaşça girdap karıştırmak için. Işıktan korunan 30 dk için 4 °C’de kuluçka numuneleri. Boyama dan sonra, 5 dk 4 °C için 300 x g santrifüj ile FACS boyama tampon ile hücreleri yıkayın. Çözeltiyi aspire edin ve FACS boyama tamponundaki hücre peletini 0,5 x 106 hücre/mL’ye yeniden askıya alın. 35 μm filtre üstleri, pipet lekeli hücre örnekleri kapakları ve yerçekimi filtrasyon üzerine tek hücresüspansiyonlar elde etmek için yeni FACS tüpleri kullanarak. Buzda kal. Hücreleri arındırmak için bir hücre ayırıcısı kullanın. Gerilimleri ayarlamak ve arka plan sinyalini düzeltmek için hücre ayırıcısındaki lekesiz hücreleri çalıştırın (örneğin, ileri dağılım için 490−560 ve yan dağılım için 180−250′ ye ayarlayın). Her kanal için voltajları ayarlamak ve pozitif sinyal için kapıları ayarlamak için her tek renkli kompanzasyon boncuk örneğini teker teker çalıştırın. Veri toplayın. Kompanse matrisini hesaplayarak spektral çakışmayı hesaplamak için yazılımı kullanın. Tüm voltajlar hazır ve ayarlanmış. Her izotip denetimini birer birer çalıştırın ve varsa belirli olmayan bağlama için kapıları ayarlamak için bu veriler kullanılabilir. Her FMO örneğini birer birer çalıştırın ve çok renkli bir panel sayesinde spektral kanamayı düzeltmek için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Lekeli hücre örneklerini hücre ayırıcısında çalıştırın ve 15 mL konik toplama tüpünde 10 mL enzimsiz kültür medyasında (DMEM + FBS + %1 P/S) hücre toplayın. Aşağıdaki gating stratejisini kullanın: tek hücreler için kapı, canlı hücreler için kapı, CD45 negatif hücreler için kapı, CD34 ve CD31 negatif hücreler için kapı, NG2 pozitif hücreler için kapı ve son olarak CD146 ve CD140b pozitif hücreler için kapı. 5. Perisit lerin Culturing 5 dk için %0,2 jelatin içeren 24 kuyulu bir plakayı kaplayın ve jelatin çözeltisini aspire edin. Tohum taze elde edilen hücreler 4.2.5 adım dmem + 20% FBS + 1% P / S kadar 2 x 104 hücreleri /cm2. Bir hücre kuluçka makinesindeki kültür hücreleri 37 °C, %5 CO2 ve O2olarak ayarlanır. Perisitlerin geçişi Hücreler konakıcı olduktan sonra hücreleri sıcak 1x DPBS ile yıkayın ve 3−5 dk oda sıcaklığında her kuyuda 200 μL 0,1 tripsin ile hücreleri kaldırın. Hücreleri gevşetmek için tabağa hafifçe dokunun. Tripsini 3,5 x kültür ortamı miktarı (700 μL DMEM + FBS + %1 P/S) ve tohum geçişi iki (P2) hücreyi 2 x 104 hücre/cm 2’ye kadar kaplamasız 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Her kuyu, ne zaman confluent, sonra 1:6 oranında bölünebilir P3 hücreleri olarak tek bir T-75 şişesine taşınabilir. 6. Perisitlerin Karakterizasyonu Akış sitometri analizi Bölüm 4’te daha önce açıklandığı gibi aynı FACS boyama protokolünü ve gating stratejisini kullanın. Akış sitometresi üzerinde kontrolleri ve lekeli örnekleri çalıştırın. Analiz yazılımını kullanarak veri toplamakve verileri analiz etmek (Malzeme Tablosu). Parlak alan görüntülerini toplamak için, 37 °C, %5 CO2 ve O2olarak belirlenen bir hücre kuluçka makinesindeki bir şişedeki hücreleri büyütün. Hücreler yüzeye bağlandıktan sonra görüntüleri mikroskopta yakalayın. İmmünositokimya Hücreleri ‘a kadar 96 kuyuluk bir tabakta büyütün. Hücreleri sıcak 1x DPBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile düzeltin. Hücreleri 1x DPBS ile 3x yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1 deterjanla permeabilize edin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca tampon engelleme ile inkübül hücreleri. Bloke sonra, birincil antikorlar ekleyin (kuyu başına bir antikor) 1:100 tampon engelleme ve 4 ° C gecede kuluçka seyreltilmiş. Primer antikorlar şunlardır: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentin, anti-desmin, ve anti-alfa düz kas aktin. Ertesi gün, yıkama tampon (TabloMalzemeler)ile hücreleri 3x yıkayın. İkincil antikor 1:1.000 bloke tampon ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat kuluçka seyreltilmiş ekleyin. İkincil antikor FITC’ye konjuge bir anti-tavşandır. Yıkama tampon ile hücreleri 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika için 1:1.000 seyreltilmiş 300 μM nükleer leke ekleyin. Hücreleri 1x DPBS ile 3 x yıkayın ve montaj lı ortamla monte edin. Konfokal mikroskoplu görüntü hücreleri.