Isolatie en zuivering van Murine cardiale Pericytes

Alle dieren werden ondergebracht en gebruikt in een vereniging voor de beoordeling en accreditatie van de geaccrediteerde faciliteit voor laboratoriumdieren verzorging International (AAALAC) en alle dierlijke werkzaamheden werden uitgevoerd onder passend veterinair toezicht en onder de institutionele dier Zorg-en gebruiks Comité (IACUC) goedgekeurd Protocol van Amgen Inc. 1. voorbereiding van gereedschap en cultuur media Autoclaaf chirurgisch 9 cm rechte punt schaar en 10 cm gehoekte Tang. Voeg 25 mL 5% foetaal runderserum (FBS) en 5 mL 1% penicillaire streptomycine (P/S) toe aan een flesje van 500 mL calcium magnesium vrij Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (CMF-DPBS). Plaats de oplossing in een ijsbad om te zorgen dat het koud zal zijn op het moment van gebruik. Aliquot 50 mL in een conische buis van 50 mL voor hart isolatie. Voeg in 250 eenheden/mL heparine natrium oplossing toe aan de 50 mL aliquot. Dit zal worden aangeduid als de gehepariniseerd CMF-dpbs. Voeg 20% FBS (100 mL) en 1% P/S (5 mL) toe aan een fles van 500 mL met hoge glucose Dulbecco’s gemodificeerde eagle’s medium (DMEM). Dit wordt de enzym vrije kweekmedia genoemd. Aliquot 20 mL DMEM + 20% FBS + 1% P/S en voeg toe in 500 μg/mL Collagenase B. Dit wordt de enzym oplossing genoemd. Houd zowel de enzym-vrije kweekmedia als de enzym oplossing warm bij 37 °C in een incubator of waterbad. 2. bereiding van dier en aankoop van hartweefsel Intraperitoneaal Injecteer een muis met 250 eenheden heparine natrium oplossing met een 31 G naald spuit. Wacht vervolgens 10 − 15 minuten terwijl de muis actief blijft in zijn huis kooi.Opmerking: Representatieve gegevens in deze studie werden verkregen van een 4 maanden oude mannelijke C57BL/6 muis. Dit protocol kan echter op elke muis worden gebruikt, ongeacht stam, leeftijd, geslacht, gewicht, enz. Anesthetiseer de muis met 5% isoflurane. Controleer de anesthesie diepte van de muis door knijpen reflex. Plaats de verdoofd Mouse in rugligging positie en plak de voorvoet in de voorgrond. Open voorzichtig de borstholte en cannulaat de aflopende aorta met behulp van een 25 G vlindernaald. Maak een Nick in het rechter atrium en parfumeer het hart met ten minste 20 ml 250 eenheden/ml gehepariniseerd CMF-dpbs bij 2 ml/min met een variabele-flow peristaltische pomp. Wanneer de PBS uit de juiste atria-clean komt, is perfusie compleet. Snijd het hart in de aorta en plaats het in de ijskoude CMF-DPBS. 3. dissociatie van hartweefsel Breng het hart over in een Petri schaaltje van 15 cm x 15 cm. Snijd het hart in kleine stukjes (1 mm/stuk) met behulp van veer schaar en fijne punt Tang met voldoende enzym oplossing om de stukken te bedekken (10 − 15 mL). Breng de stukken en de oplossing over in een conische buis van 50 mL, sluit af met een plastic folie van paraffine en inincuberen bij 37 °C op een rondschudapparaat bij 120 rpm gedurende 75 min. Na Collagenase spijsvertering met de enzym oplossing, decanteren de vloeistof door een 100 μm cel zeef in een nieuwe 50 mL buis maar laat voldoende oplossing om ervoor te zorgen dat de stukken niet uitdrogen. Met behulp van fijne punt Tang, haal het weefsel uit de buis en plaats een paar stukjes op een Microscoop glijbaan. Slijp vervolgens het weefsel tussen twee Microscoop dia’s om het weefsel te breken. Spoel de dia’s met de enzym vrije kweekmedia in een nieuwe conische buis van 50 mL. Herhaal stap 3,4 totdat alle weefsel stukken zijn losgekoppeld. Combineer de oplossingen van de stappen 3.3 − 3.5 in één buis. Zeef de resulterende suspensie door een 100 μm celzeef in een nieuwe conische buis van 50 mL. Centrifugeer bij 220 x g, 4 °c, gedurende 5 min. aspirate uit vorige oplossing en voorzichtig respenderen celpellet in verse enzym-vrije cultuur media. Tel cellen en controleer de levensvatbaarheid met behulp van een cel teller. Verdun cellen tot 1 x 106/ml met een koude FACS kleurings buffer met 500 ml dpbs en 10 − 25 ml van 2 − 5% boviene serumalbumine (BSA). De cellen zijn klaar om te worden gekleurd en gesorteerd. 4. zuivering van Pericytes aan ruw Celmengsel met behulp van FACS Bereid en label 5 mL FACS buizen voor alle besturingselementen en celmonsters. Aliquot-cellen (1 mL cellen per buis) voor een onbevlekt monster, fluorescentie minus één (FMO)-besturingselementen en Isotype-afgestemde controles. Gebruik de resterende cellen voor de sorteervolgorde. Alle bedieningselementen en samples kunnen tegelijkertijd worden voorbereid en gekleurd.Opmerking:Een totaal van 13 mL bij 0,5 x 106cellen/mL werden gebruikt voor de representatieve sortering uit één hart. Het volume hangt echter af van het aantal cellen dat de onderzoeker verkrijgt uit hun isolement, hoeveel harten ze gebruiken en hoe goed het hartweefsel wordt verteerd; de grootte van elk hart is ook een variabele die het volume kan veranderen.Gebruik compensatie kralen (tabel met materialen) om fluorescentie compensatie controles te optimaliseren. Bereid één compensatieregeling voor elk fluor chroom in het experiment in een gelabelde 5 mL FACS Tube. Voor dit experiment, voorbereiden van een totaal van 9 compensatie controles-2 soorten Onbevlekte kralen plus 7 verschillende fluorochromes van het markerings paneel met inbegrip van NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, en levensvatbaarheid van de cel-APC-Cy7 ( Tabel met materialen). Voeg één druppel compensatie kralen (~ 50 μL) toe van de knijp flacon in elke buis. Voeg vervolgens 1 μL antilichaam toe aan de kralen. Herhaal dit voor elk antilichaam in het markerings paneel. Meng krachtig door puls-vortexing. Inbrokkelen gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht, met uitzondering van de levensvatbaarheid van de cellen die kunnen worden achtergelaten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voeg vervolgens 3 mL FACS kleuring buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspirate-oplossing en hervat elke kraal pellet in 400 μL FACS kleurings buffer. De compensatie controles zijn klaar om te worden gebruikt. Blijf op ijs. Gebruik FMO-besturingselementen om achtergrondkleuring te optimaliseren als gevolg van spectrale overlap. Bereid FMO-besturingselementen voor door 1 mL cellen te gebruiken die in een 5 mL FACS Tube zijn geciteerd uit punt 4,1 en toe te voegen aan alle antilichamen van het markerings paneel zoals beschreven in stap 4.1.1 bij een verdunning van 1:100 maar met uitzondering van één antilichaam. Bereid bijvoorbeeld een NG2-AF488 FMO met antilichamen voor CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, kleurstof voor de levensvatbaarheid van de cellen, maar niet het NG2-AF488 antilichaam. Meng zachtjes door puls-vortexing. Herhaal dit voor elk antilichaam voor een totaal van 7 controles. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht. Voeg vervolgens 3 mL FACS kleuring buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspirate-oplossing en reresumeer elke celpellet in 400 μL FACS kleurings buffer. De FMO-besturingselementen zijn klaar om te worden gebruikt. Blijf op ijs. Gebruik Isotype-gecompenseerde controle antilichamen (inhoudstafel) voor niet-specifieke kleuring. Bereid Isotype-besturingselementen door de Isotype-gecompenseerde controle antilichamen (tabel met materialen) toe te voegen aan 1 ml celmonster, bereid uit paragraaf 4,1 bij een 1:100 verdunning elk in een 5 ml FACS buis. Meng zachtjes door puls-vortexing. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht. Voeg vervolgens 3 mL FACS kleuring buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspirate-oplossing en reresumeer elke celpellet in 400 μL FACS kleurings buffer. De Isotype-bedieningselementen zijn klaar om te worden gebruikt. Blijf op ijs. Bereid de cellen voor om gesorteerd te worden door een antilichaam cocktail toe te voegen aan vers geïsoleerde cellen. Bereid het celmonster uit paragraaf 4,1 door toevoeging van een antilichaam cocktail met anti-muis NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 bij 1:100 verdunning en kleurstof voor de levensvatbaarheid van de cellen bij 1:1000 verdunning. Zachtjes Vortex om te mengen. Inincuberen monsters bij 4 °C gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Na het vlekken, spoel cellen met een FACS kleuring buffer door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min 4 °c. Aspirate-oplossing en reresumeer de celpellet in FACS kleurings buffer naar 0,5 x 106 cellen/ml. Gebruik nieuwe FACS tubes met 35 μm filter tops, Pipetteer gekleurde celmonsters op de deksels en zwaartekracht filtraat om enkelvoudige celsuspensies te verkrijgen. Blijf op ijs. Gebruik een celsorteerder om cellen te zuiveren. Voer de niet-bevlekte cellen op de celsorteerder uit om spanningen in te stellen en corrigeer voor het achtergrond signaal (Stel bijvoorbeeld spanningen in voor voorwaartse spreiding naar 490 − 560 en voor zijspreiding naar 180 − 250). Voer elke enkele kleur compensatie kraal monster een voor een om spanningen voor elk kanaal aan te passen en de poorten voor het positieve signaal aan te passen. Gegevens verzamelen. Gebruik de software om te berekenen voor spectrale overlap door de compensatiematrix te berekenen. Alle spanningen zijn klaar en ingesteld. Voer elk Isotype-besturingselement een voor een uit en deze gegevens kunnen worden gebruikt om Gates aan te passen voor niet-specifieke binding als die er zijn. Voer elke FMO-sample één op tijd uit en pas de spanningen voor elk kanaal aan om te corrigeren voor spectrale afloop door een multi-kleuren paneel. Voer de bevlekte celmonsters in de celsorteerder en verzamel cellen in 10 mL-enzym vrije kweekmedia (DMEM + 20% FBS + 1% P/S) in een conische verzamelbuis van 15 mL. Gebruik de volgende gating strategie: Gate voor enkele cellen, poort voor levende cellen, poort voor CD45 negatieve cellen, poort voor CD34 en CD31 negatieve cellen, poort voor NG2 positieve cellen, en ten slotte Gate voor CD146 en CD140b positieve cellen. 5. culturing van Pericytes Jas een 24-goed bord met 0,2% gelatine voor 5 min en aspiraat uit gelatine oplossing. Zaai vers verkregen cellen uit stap 4.2.5 in DMEM + 20% FBS + 1% P/S tot 2 x 104 cellen/cm2. Kweekcellen in een celincubator ingesteld op 37 °C, 5% CO2 en 95% O2. Passage van pericytes Zodra de cellen 95% Confluent zijn, wassen cellen met warme 1x DPBS, en heffen cellen met 200 μL 0,1% trypsine in elk goed bij kamertemperatuur voor 3 − 5 min. Tik zachtjes op de plaat om de cellen los te maken. Neutraliseer de trypsine met 3.5 x de hoeveelheid kweekmedia (700 μL DMEM + 20% FBS + 1% P/S) en zaad passage twee (P2) cellen op een ongecoate 6-put plaat op 2 x 104 cellen/cm2. Elk goed, wanneer Confluent, kan worden verplaatst in een enkele T-75 kolf als P3 cellen die vervolgens kunnen worden gesplitst bij een 1:6 ratio. 6. karakterisering van Pericytes Analyse van flow cytometrie Gebruik hetzelfde FACS-kleurings protocol en de gating-strategie zoals eerder beschreven in sectie 4. Voer besturingselementen en bevlekte monsters op de flow cytometer. Gegevens verzamelen en analyseren met behulp van de analyse software (tabel met materialen). Om brightfield-beelden te verzamelen, kweek je cellen in een kolf in een celincubator die is ingesteld op 37 °C, 5% CO2 en 95% O2. Leg beelden vast op een Microscoop nadat de cellen aan het oppervlak zijn bevestigd. Immunocytochemie Kweekcellen in een 96-put plaat tot 90% Confluent. Spoel cellen met warm 1x DPBS en fixeer met 4% Paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was cellen 3x met 1x DPBS en permeabilize met 0,1% wasmiddel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Inincuberen cellen met blokkeerbuffer voor 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg na het blokkeren primaire antilichamen (één antilichaam per put) verdund 1:100 in blokkerende buffer en incuberen bij 4 °C ‘s nachts. Primaire antilichamen zijn: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentine, anti-desmin, en anti-alpha glad spier actin. Volgende dag, wassen cellen 3x met Wash buffer (tabel van de materialen). Voeg secundair antilichaam verdund 1:1000 toe in blokkerende buffer en inincuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker. Secundair antilichaam is een anti-konijn geconjugeerd aan FITC. Was cellen 3x met Wash buffer. Voeg 300 μM kern vlek verdund bij 1:1000 gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Spoel de cellen 3x met 1x DPBS en bevestig met de montage media. Beeld cellen met een confocale Microscoop.