Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

1. generatie van multicellulaire tumor Sferoïden Opmerking: Het protocol is hier aangetoond met UT-SCC-42A en-42B cel lijnen, maar het kan ook worden toegepast met behulp van andere cellen lijnen. Was de UT-SCC-42A en-42B cellen met 6 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS); Voeg 0,05% trypsine-EDTA (3 mL voor 75 cm2 kolf), en plaats de kolf in een cel kweek incubator (37 °c, 5% Co2, 95% vochtigheid) voor 2-5 min. Controleer of de cellen onder een Microscoop zijn losgemaakt. Voeg vervolgens complete Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) media (DMEM + 10% foetale boviene serum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 250 ng/mL amfotericine B, 0,4 μg/mL hydrocortison, en 50 μg/mL ascorbinezuur) om het enzym te neutraliseren (6 mL voor 75 cm 2 kolf) en breng de cel schorsing in een 15 ml conische buis.Opmerking: Selecteer de cel cultuurmedium dat past bij de cellen worden bestudeerd. Centrifugeer de cel suspensie bij 200 x g voor 5 min. Verwijder de bovendrijvende en Suspendeer de Cell pellet in 2-5 mL van de volledige DMEM. Tel de cellen en Verdun de cel schorsing met volledige DMEM tot een definitieve concentratie van 20.000 cellen/mL.Opmerking: Voor elke cel regel moet een optimaal aantal cellen worden bepaald. Doseer 50 l van de cel schorsing in elke ultra-lage gehechtheid 96-goed ronde bodemplaat goed voor een definitieve concentratie van 1.000 cellen per put. Breng de plaat naar de cel kweek incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid). Vier dagen later, visueel te bevestigen tumor sferoïde vorming met een omgekeerde Microscoop en verder met de assay. Zorg ervoor dat er slechts een sferoïde per well.Opmerking: De tijd die wordt genomen om een sferoïde te vormen varieert tussen verschillende cel lijnen. 2. driedimensionale sferoïde invasie assay Opmerking: Bereid 2x oplossing omdat de gel zal worden verdund 1:1 wanneer toegevoegd in de putten. Dooi HMDM op ijs en fibrinogeen voorraadoplossing in een waterbad gehandhaafd bij 37 °C. Verstoort niet de fibrinogeen tot het volledig solubilized is en zet niet de oplossing op ijs; neerslag zal optreden. Meng het juiste volume van elk reagens samen: 1 mg/mL HMDM (eindconcentratie: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL trombine (eindconcentratie: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (eindconcentratie: 33,3 UG/mL), en 1 mg/mL fibrinogeen (eindconcentratie: 0,5 mg/mL ).Opmerking: Voeg fibrinogeen net voor het doseren van het mengsel in de putten en werken snel; het zal vormen een gel in een paar minuten. Behandel slechts een paar putten op een moment. Voeg 50 l van de gel in elk goed. Direct de tip naar de binnenwand van de put en pipet langzaam. Vermijd luchtbellen (met behulp van de omgekeerde Pipetting techniek) en probeer niet om de sferoïde te verplaatsen van het centrum van de put. Breng de plaat terug naar de cel kweek incubator en laat de HMDM/fibrinematrix te stollen voor 30 min, en zachtjes toe te voegen 100 l van volledige DMEM in elk goed op de top van de gel. 3. Imaging Afbeelding van de sferoïden dagelijks met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop. U ook automatische imaging systemen gebruiken. 4. beeldsegmentatie met Ilastik Open ilastik en selecteer de werkstroom van de pixel classificatie (Figuur 1a). Het classificeert de pixels op basis van aantekeningen gemaakt door de gebruiker. Sla ilastik project (. Ilp) op de computer op. Voeg afbeeldingen toe voor analyses. Klik op invoergegevens en Voeg nieuw toe en kies vervolgens afbeeldingen (Figuur 1B). Klik voor functie selectie op functie selectie en selecteer functies (Figuur 1C, rode rechthoek).Opmerking: de geselecteerde functies moeten ruwweg overeenkomen met de visuele eigenschappen die de objecten scheiden van de achtergrond, en ze zullen worden gebruikt voor het trainen van de classificatie. Selecteer functies door op de vakjes te klikken. De geselecteerde vakken worden groen weer (Figuur 1C, blauwe rechthoek).Opmerking: Hier kan de gebruiker kiezen uit verschillende feature types en schalen. Kleur/intensiteit moet worden geselecteerd om objecten te scheiden op basis van kleur of helderheid. De rand moet worden geselecteerd om objecten te scheiden op basis van helderheid of kleurovergangen. Textuur is een belangrijke functie als de objecten in de afbeelding hebben een speciale textuur verschijning. Voor deze analyse worden kleur/intensiteit (Sigma 0) en Edge (Sigma 6) gebruikt. Voor training klikt u op training en in de sectie training zijn er twee labels: label 1 en Label 2 (Figuur 1D, rode rechthoek). Als er maar één label is, voegt u een nieuw label toe door op label toevoegen te drukken (Figuur 1D, blauwe rechthoek). Markeer de achtergrond met een van de labels (Figuur 1d, geel) en de cellen met het andere label (Figuur 1d, blauw). Train de software voor de eerste 10% van de beelden. Kies volgende afbeelding uit de huidige weergave. Nadat de cellen en de achtergrond zijn gemarkeerd (van de eerste afbeelding), drukt u op Live Update (Figuur 1D, paarse rechthoek).Nota: met het volgende beeld, zal ilastik automatisch de analyse volgens de vorige beelden uitvoeren. Na de training is gedaan en ilastik heeft alle afbeeldingen geanalyseerd, klikt u op predictie export. Kies eenvoudige segmentatie van bron; Kies niet waarschijnlijkheden of iets anders (Figuur 1E). Kies de gewenste output bestandsformaat van Kies export image settings… in de predictie export sectie (Figuur 1E). Exporteer de resultaten van de labeling door te klikken op Alles exporteren (Figuur 1F). De bestanden zullen worden geëxporteerd naar dezelfde map met de originele beelden.Opmerking: in dit experiment wordt. H5-indeling gebruikt. 5. de analyse van het gebied met Fiji ImageJ Schaalinstelling Open de originele afbeelding met een schaalbalk in Fiji ImageJ (Figuur 2a). Zorg ervoor dat de afbeelding dezelfde grootte en afmetingen heeft als de geanalyseerde afbeeldingen. Gebruik het gereedschap lijn selecteren om een lijn van een bekende lengte te tekenen (Figuur 2B).Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) en ilastik-1.3.2 rc. Klik op analyse en Stel schaal in (Figuur 2C). Stel de bekende afstand in op het bekende afstands veld en stel de juiste eenheid in en klik op globaal (Figuur 2D). De macro installeren Als een plugin ilastik niet is geïnstalleerd, volg deze stappen: Klik op Help, Update…. Klik in het venster ImageJ Updateropenen op Update sites beheren. Klik in het geopende venster Update sites beherenop naast ilastik en klik vervolgens op sluiten. Klik vervolgens op wijzigingen toepassen in het venster ImageJ Updater. Dit proces kan enige tijd duren. Het volgende venster zal informatie zijn met de tekst met succes bijgewerkt. Tikken okee en herstarten ImageJ. Klik op Plug-ins, macro’sen installeren (Figuur 3a). Kies vervolgens het bestand Counter. IJM (Zie aanvullende informatie) en klik op openen.Opmerking: De macro is speciaal geschreven voor het meten van het gebied. De macro moet worden geïnstalleerd elke keer dat de software wordt geopend. Gebied analyse Analyseer afbeeldingen wanneer alle plug-ins zijn geïnstalleerd. Klik op plugins en scroll naar beneden naar ilastik (Figuur 3C). Kies import hdf5, kies het bestand met. H5 formaat, klik op openen en laden en toepassen Lut (Figuur 3C, D). Druk op de a -knop van het toetsenbord (macro) en het gebied zal verschijnen in de Samenvatting venster als totaal gebied (Figuur 3E).