En række metoder til at bestemme den potentielle DNRA sats baseret på 14NH4+/15NH4+ analyser leveres i detaljer. NH4+ omdannes til N2O via flere trin og analyseres ved hjælp af quadrupole gaskromatografi-massespektrometri.
Betydningen af at forstå nitrattens skæbne (NR3−), som er den dominerende N-art, der overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har været stigende, fordi den globale kvælstofbelastning er steget dramatisk efter industrialiseringen. Dissimilatoriske nitratreduktion til ammonium (DNRA) og denitrificering er begge mikrobielle processer, der bruger NO3− til respiration. Sammenlignet med denitrificering er der kun i begrænset omfang foretaget kvantitative bestemmelser for DNRA’s aktiviteter. Dette har ført til en utilstrækkelig forståelse af DNRA’s betydning i NR3− transformationer og reguleringsfaktorerne i denne proces. Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en detaljeret procedure for måling af den potentielle DNRA-rate i miljøprøver. Kort sagt kan den potentielle DNRA-rate beregnes ud fra den 15N-mærkede ammonium (15NH4+) akkumuleringsrate i 15NO3− tilsat inkubation. Bestemmelsen af de 14NH4+ og 15NH 4+ koncentrationer,der er beskrevet i dette papir, består af følgende trin. For det første udvindesNH 4+ i prøven og fanges på et forsuret glasfilter som ammoniumsalt. For det andet eluteres det fangne ammonium og oxideres til NO3− via persulfatoxidation. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktasedetændig denitrifier. Endelig analyseres den konverterede N2O ved hjælp af et tidligere udviklet firedobbelt gaskromatografi-massespektrometrisystem. Vi anvendte denne metode til salt marsh sedimenter og beregnet deres potentielle DNRA satser, viser, at de foreslåede procedurer giver mulighed for en enkel og hurtigere bestemmelse i forhold til tidligere beskrevne metoder.
Den kunstige syntese af kvælstofgødning og dens udbredte anvendelse har i høj grad forstyrret den globale kvælstofcyklus. Det anslås , at overførslen af reaktivt kvælstof fra jordbaserede til kystbaserede systemer er fordoblet siden førindustrielletider 1. En betydelig del af gødningen, der anvendes på et givet felt, vaskes væk fra jorden til floder eller grundvand, primært som NR3− 2. Dette kan forårsage miljøproblemer såsom drikkevandsforurening, eutrofiering og dannelse af hypoxi. NO3− fjernes i vandmiljøer fra eller bevares i økosystemet via biologisk assimilation og forskellige mikrobielle dissimilatoriske processer. Denitrificering og anammox er kendt for at være større mikrobielle fjernelsesprocesser for NO3−. Denitrificering er den mikrobielle reduktion af NO3− til gasformige N-produkter (NO, N2O og N2) kombineret med oxidering af en elektrondonor, såsom organiske stoffer, hvilket reducerer risikoen for ovennævnte problemer. Anammox producerer også N2 fra NO2− og NH4+; derfor fjerner den uorganiske N fra et økosystem. Omvendt arbejder DNRA på at bevare N i et økosystem. det er almindeligt accepteret, at DNRA primært udføres af fermentative bakterier eller chemolithoautotrofiske bakterier, og at de reducerer dissimilatory NO3− til biotilgængelige og mindre mobile NH4+.
Undersøgelser af DNRA er primært blevet udført i marine eller flodmundinger økosystemer, såsom oceaniske eller flodmundinger sedimenter og vand, salt eller brakvand marsh jord, og mangrove jord. Kyst- eller havøkosystemer er vigtige som reservoirer til fjernelse af NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere undersøgelser har DNRA vist sig at bidrage over et meget bredt udvalg af NO3− fjernelse (0-99%)3,4,5,6,77,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.9 Endvidere er eksistensen af DNRA blevet påvist i en lang række miljøer, herunder ferskvandsmiljøer19, rismarkeljord20og skovjord21. Mens disse undersøgelser har vist, at DNRA potentielt kan sammenlignes med denitrificering for NO3− fjernelse, er undersøgelser, der måler DNRA-aktiviteten, stadig meget begrænsede sammenlignet med dem, der måler denitrificering.
DNRA-hastigheden er blevet evalueret ved hjælp af 15N-mærkningsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analyseløsning til beregning af DNRA-hastigheden er baseret på stigningen i 15 N-berigelsenaf NH4+ puljen efter tilsætning af 15NO3− som sporstof. kr. N-mærket NO3− tilsættes til en prøve og inkuberes, og DNRA-hastigheden kan derefter beregnes ud fra koncentrations- og isotopforholdsændringerne i NH4+ før og efter en vis periode. I dette dokument beskrives en metode til kvantificering af NH4+koncentrationen og isotopforholdet, som er nødvendigt for at beregne DNRA-hastigheden, i detaljer. Dybest set, den metode, der rapporteres her er en kombination af flere tidligere rapporterede teknikker22,,23,24,25,26 med ændringer føjet til nogle procedurer. Metoden består af en serie på fem komponentprocedurer: 1) inkubation af en miljøprøve med ændring af et stabilt isotopsporingsmiddel, 15NO3−, 2) ekstraktion og nyttiggørelse af NH4+ ved hjælp af en “diffusionsprocedure” med ændringer, 3) persulfatoxidation af NH4+ i prøven bestående af indenlandske NH4+ og 15NH4+ afledt af 15NO3− via DNRA aktivitet, i NO3− og 15NO3−, (4) efterfølgende mikrobiel transformation af NO3− og 15NO3− til N2O-isotopomere via den modificerede denitrifiermetode og (5) kvantificering af N2O-isotopomerne ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC/MS). I det følgende afsnit beskrives først forberedelsen af procedurerne (2) og 4), og derefter beskrives alle fem komponentprocedurer i detaljer.
Koncentrations- og isotopforholdet for NH4+ for DNRA-analysen blev kvantificeret ved hjælp af flere metoder. Koncentrationerne og isotopforholdet for NH4+ måles generelt separat. NH4+ koncentrationen måles typisk ved hjælp af koloimetriske metoder , herunder en autoanalyser4,10,15,16,17. Iso…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Naoto Tanaka for at hjælpe med dataindsamling og udvikling af protokollen. Indsamlingen af prøver blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.
15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |