Vi presenterar detaljerade protokoll för att utföra små-vinkel X-ray diffraktion experiment med intakt mus skelett muskler. Med den stora tillgängligheten av transgena musmodeller för mänskliga sjukdomar, kan denna experimentella plattform bilda en användbar testbädd för att belysa den strukturella grunden för genetiska muskelsjukdomar
Transgena musmodeller har varit viktiga verktyg för att studera förhållandet mellan genotyp och fenotyp för mänskliga sjukdomar, inklusive de av skelettmuskulaturen. Mus skelettmuskel har visat sig producera högkvalitativa röntgen diffraktionsmönster på tredje generationens synkrotron beamlines ger en möjlighet att koppla förändringar på nivån av genotyp till funktionella fenotyper i hälsa och sjukdom genom att fastställa de strukturella konsekvenserna av genetiska förändringar. Vi presenterar detaljerade protokoll för beredning av prover, samla in röntgen mönster och extrahera relevanta strukturella parametrar från röntgen mönster som kan hjälpa vägleda praktiker som vill utföra sådana experiment för sig själva.
Synchrotron liten vinkel röntgendiffraktion är den metod för val för att studera nm-skalan struktur aktivt upphandlande muskel beredningar under fysiologiska förhållanden. Viktigt, strukturell information från levande eller flådde muskel preparat kan erhållas i Synchrony med fysiologiska data, såsom muskelkraft och längdförändringar. Det har ökat intresset för att tillämpa denna teknik för att studera den strukturella grunden för ärftliga muskelsjukdomar som har sin grund i punktmutationer i sarcomeric proteiner. Den muskel biofysik samfundet har varit mycket aktiv i att generera transgena musmodeller för dessa sjukdomar hos människor som kan ge idealiska testbäddar för strukturella studier. Senaste publikationer från vår grupp1,2,3 och andra4,5 har indikerat att röntgenbilder från musen extensor digitorum longus (EDL) och soleus muskler kan ge alla diffraktions information tillgänglig från mer traditionella modellorganismer såsom groda och kanin psoas skelettmuskulaturen. En fördel med musen skelettmuskulaturen förberedelse är enkel dissektion och utföra grundläggande membran-intakt, hela muskler fysiologiska experiment. Dimensionerna av dissekerade muskler har tillräcklig massa för att ge mycket detaljerade muskelmönster i mycket korta röntgen exponeringstider (~ millisekund per bildruta) på tredje generationens X-ray beamlines.
Muskel röntgendiffraktion mönster består av de ekvatoriella reflektioner, Meridional reflektioner samt skikt linje reflektioner. Den ekvatoriella intensitet ratio (förhållandet mellan intensiteten i 1, 1 och 1,0 ekvatoriella reflektioner, jag11/I10), är nära korrelerad till antalet bifogade Cross-broar, som är proportionell mot den kraft som genereras i mus skelettmuskel 2. Meridional reflektioner som rapporterar perioditeter inom tjocka och tunna trådar kan användas för att uppskatta glödtråden utökningsbarhet1,3,6,7. Diffraktion funktioner inte på meridianen och ekvatorn kallas lager linjer, som uppstår från den ungefär spiralt beställde myosin huvuden på ytan av tjocka glödtråden ryggrad samt ungefär spiralt beställde tunna glödtrådar. Intensiteten av myosin skikt linjer är nära besläktad med graden av beställning av myosin huvuden under olika förhållanden2,8. All denna information kan användas studera beteenden av sarcomeric proteiner in situ i hälsa och sjukdom.
Synchrotron röntgendiffraktion av muskler har historiskt gjorts av grupper av högt specialiserade experter men framsteg inom teknik och tillgången till nya data verktyg för minskning tyder på att detta inte alltid behöver vara fallet. Den BioCAT Beamline 18ID vid avancerad Photon källa, Argonne National Laboratory har dedikerade personal och stöd för att utföra muskel röntgendiffraktion experiment som kan hjälpa nykomlingar till fältet komma igång med att använda dessa tekniker. Många användare väljer att formellt samarbeta med biocat personal, men ett ökande antal användare tycker att de kan göra experiment och analys själva minska bördan på fd personal. Det primära målet med denna uppsats är att tillhandahålla utbildning som ger potentiella försöksledaren med den information de behöver för att planera och utföra experiment på mus skelettmuskel systemet antingen på biocat fd eller vid andra höga Flux beamlines runt världen där dessa experiment skulle vara möjliga.
Senaste publikationer från vår grupp visade att röntgen mönster från musen skelettmuskulaturen kan användas för att belysa sarcomeric strukturell information från muskler i hälsa och sjukdom1,2,3 särskilt med den ökade tillgängligheten av genetiskt modifierade musmodeller för olika myopatier. Högupplöst mekaniska studier på enstaka fibrer eller små buntar kombinerat med röntgendiffraktion görs bäst av experter. Om, emellertid, mer blygsam mekanisk information kommer att räcka för dina ändamål, hela muskeln preparatet tillåter insamling av detaljerade röntgen mönster från en enkel beredning.
En ren dissektion är nyckeln till en lyckad kombinerad mekanisk och röntgen experiment. Det är mycket viktigt att inte dra på mål muskeln samt andra muskler i samband med soleus eller EDL muskler under dissektion eftersom detta kan riva delar av muskeln och leda till minskad kraft. Det kan också leda till skadade inre struktur som kommer att försämra röntgen mönster. Eftersom allt kommer att sprida sig i röntgenstrålen, är det viktigt att rengöra bort eventuella extra fett, kollagen i fascia samt alla hårstrån eller lösa bitar av vävnad medan du gör följande protokoll. För att minska ytterligare efterlevnad i muskeln preparatet, det är också viktigt att säkert binda senor till krokar, så nära som möjligt till muskel kroppen utan att skada den.
Olika X-ray exponeringstider kan ge olika typer av information från samma muskel. Med full stråle på 18ID kan ett analyserbart ekvatoriellt mönster erhållas i en 1 MS-exponering (se figur 2D). För en analyserbart första myosin skikt linje reflektion, en 10 MS total exponeringstid krävs normalt. För att samla högre ordning Meridional reflektioner såsom M15 (2,8 nm myosin Meridional reflektion) och 2,7 nm aktin Meridional reflektion, typiskt minst 1 s totala exponeringen krävs men mer än 2 s totala exponeringen rekommenderas för hög noggrannhet Mätningar.
Valet av optimal röntgen detektor för experimentet är viktigt. För de mest detaljerade röntgen mönster en anpassad CCD-detektor, såsom den på BioCAT med ca. 40 μm pixlar och ~ 65 μm punkt sprids funktioner i fosfor, kan ge mönster med hög dynamiskt omfång och god rumslig upplösning men kan bara ta en ram i taget. För tid löst experiment, den Photon Counting pixel array detektor på BioCAT kan samla röntgen mönster på 500 Hz. Den 172 μm pixelstorlek med denna detektor, dock inte ger tillräcklig rumslig upplösning för detaljerade studier av den inre delen av meridianen, men är tillräcklig för de flesta andra ändamål. BioCAT förvärvade en högupplöst Photon Counting detektor som ger 75 μm verklig upplösning vid maximal bildhastighet på 9 000 Hz. liknande detektorer av denna typ förväntas ersätta nuvarande detektorer för muskel studier under de närmaste åren.
Med de mycket höga flödena av röntgenstrålar vid tredje generationens synchrotrons är strålningsskador ett allvarligt bekymmer. Det är alltid ett bra val att dämpa strålen för att leverera ingen mer balk än vad som behövs för att Observera de önskade diffraktion funktioner. Samma totala X-ray-exponering kan uppnås genom att förlänga exponeringstiden från en försvagad stråle. En fördel med Photon Counting pixel array detektorer är att enskilda ramar kan summeras tillsammans utan buller straff. Även då är strålningsskador möjligt. Tecken på strålningsskador inkluderar droppe av maximal kraft av kontraktion, smetar av lager linje reflektioner, även förändring av muskel färg.
En av begränsningarna i intakt mus skelettmuskel förberedelse är svårigheten att få sarcomere längd från intakt muskler under experimenten. Musklerna är för tjocka för videomikroskopi och laser diffraktion. Även med framtida utveckling kan det vara möjligt att uppskatta sarcomere längd direkt från diffraktion mönster14, i den närmaste tiden det enda alternativet är att mäta det efter experimentet som beskrivs här.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning används resurser av den avancerade Photon källa, en US Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning drivs för DOE Office of Science av Argonne National Laboratory under kontrakt nr. DE-AC02-06CH11357. Detta projekt stöddes av Grant P41 GM103622 från det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health. Användning av Pilatus 3 1M detektor tillhandahölls av Grant 1S10OD018090-01 från NIGMS. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som det nationella institutet för allmänmedicin eller National Institutes of Health har.
#5 forceps | WPI | 500342 | |
4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
micro scissor | WPI | 503365 | |
motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |