Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína
Summary
Aquí se presenta un protocolo para medir las células CD4+ T proliferantes en respuesta a proteínas antigénicas o péptidos mediante dilución de tinte. Este ensayo es particularmente sensible a las células T específicas del antígeno poco frecuente y se puede modificar para facilitar la clonación de células específicas del antígeno.
Abstract
Descrito es un método simple, in vitro, basado en la dilución de tinte para medir la proliferación de células CD4+ T específicas de antígenos en células mononucleares de sangre periférica humana (PPC). El desarrollo de tintes fluorescentes estables, no tóxicos, como el éster de carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE) permite distinguir las células T raras específicas del antígeno de los transeúntes por la disminución de la tinción fluorescente, detectada por la citometría de flujo. Este método tiene las siguientes ventajas sobre los enfoques alternativos: (i) es muy sensible a las células T de baja frecuencia, (ii) no se requiere conocimiento del antígeno o epítopo, (iii) se puede analizar el fenotipo de las células que responden, y (iv) ser viable, responder, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo células se pueden ordenar y utilizar para análisis adicionales, como clonación de células T.
Introduction
La capacidad de detectar y estudiar células T específicas del antígeno es importante en estudios de inmunidad mediada por células. Sin embargo, hacerlo es particularmente difícil para las respuestas CD4+ Células T específicas de autoantígenos, que son muy débiles y difíciles de detectar. Un método común utilizado para la detección de la proliferación de linfocitos específicos de antígenos es [3H]-timidina, que es un nucleótido radiomarcado incorporado en el ADN de las células que proliferan. Aunque el ensayo [3H]-timidina puede detectar la síntesis de ADN, este método es una medida indirecta de la división celular, porque la síntesis de ADN puede iniciarse independientemente de la mitosis (es decir, durante la duplicación de genes y la apoptosis1). Este problema se agrava por el hecho de que la proliferación específicade antígenos de las células puede resultar en una apoptosis considerable 2, lo que conduce a una posible sobreestimación de la proliferación específica de antígenos. Además, el método [3H]-timidina no proporciona información fenotípica para los linfocitos que proliferan, como CD4+ o CD8+ proliferación de linaje en PMC estimulado con péptidos antigénicos.
En 2003, publicamos el primer ensayo de dilución de colorante utilizando CFSE, denominado ensayo de proliferación basado en CFSE3,4. CFSE es un tinte fluorescente que se une establemente a las proteínas intracelulares mediante la formación de un enlace covalente a los residuos de lisina intracelular. Dado que las proteínas etiquetadas por CFSE se dividen equitativamente entre las células hijas3, las células que se han dividido se pueden distinguir de las células no divididas por la citometría de flujo, lo que también permite el fenotipado cuantitativo de las poblaciones de linfocitos. De hecho, el número de divisiones a las que ha sufrido una céluladesde el momento de la tinción CFSE se puede medir hasta cierto grado 5. Más recientemente, se han desarrollado muchos tintes similares como CellTrace Violet proliferation dye (VPD)y CytoTrack dye, que funcionan de una manera similar 6. Este protocolo se centra en la CFSE, pero los principios se aplican por igual a otros dedos relacionados.
La tinción de tetramer péptido-MHC es un método ampliamente utilizado para detectar y clonar células CD8+ T específicas de antígenos. Este es un método bien establecido7,8,9,10; sin embargo, la clonación basada en tetrameros requiere el conocimiento existente de la restricción del epítopo/MHC y cada epítopo requiere su propio tetramémero11,lo que limita el alcance del descubrimiento y clonación de células T nuevas específicas de epítopos. La proliferación basada en CFSE se puede utilizar con péptidos, proteínas o lisados celulares. El protocolo descrito en este documento es simple y robusto, y las células CD4+ T que responden se pueden clasificar para su uso en ensayos de caracterización funcional y bioquímica aguas abajo12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La proliferación basada en CFSE es un método simple y robusto para detectar y enumerar células CD4+ T humanas específicas del antígeno. Se ha demostrado previamente que el uso de la concentración óptima de CFSE es esencial para obtener resultados óptimos4. Demasiada CFSE abroga la proliferación, mientras que muy poco no permite distinguir las células divididas e indivisas. Por el contrario, se utilizan concentraciones relativamente altas (5,0 m)de CFSE …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). El Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Programa de Apoyo a la Infraestructura Operacional del Gobierno Victoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.) y NHMRC Beca de posgrado APP1094337 y Beca JDRF Ph-up (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
Referencias
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
