Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Summary
Présenté ici est un protocole pour mesurer la prolifération des cellules CD4T en réponse à des protéines antigéniques ou des peptides en utilisant la dilution des colorants. Cet analyse est particulièrement sensible aux rares lymphocytes T spécifiques à l’antigène et peut être modifié pour faciliter le clonage des cellules spécifiques à l’antigène.
Abstract
Décrit est une méthode simple, in vitro, colorant basée sur la dilution pour mesurer la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l’antigène dans les cellules mononucléaires périphériques humaines (PBMC). Le développement de colorants fluorescents stables, non toxiques, tels que carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) permet de distinguer les lymphocytes T rares et spécifiques à l’antigène des passants par diminution de la coloration fluorescente, telle qu’elle est détectée par la cytométrie du débit. Cette méthode présente les avantages suivants par rapport aux approches alternatives : (i) elle est très sensible aux lymphocytes T à basse fréquence, (ii) aucune connaissance de l’antigène ou de l’épitopie n’est requise, (iii) le phénotype des cellules répondantes peut être analysé, et (iv) viable, répondant les cellules peuvent être triées et utilisées pour une analyse plus approfondie, comme le clonage des lymphocytes T.
Introduction
La capacité de détecter et d’étudier les lymphocytes T spécifiques à l’antigène est importante dans les études de l’immunité à médiation cellulaire. Cependant, cela est particulièrement difficile pour les réponses CD4et Lymphocellulaires spécifiques à l’autoantigène, qui sont très faibles et difficiles à détecter. Une méthode courante utilisée pour la détection de la prolifération des lymphocytes spécifiques à l’antigène est [3H]-thymidine, qui est un nucléotide radio-étiqueté incorporé dans l’ADN des cellules proliférantes. Bien que l’analyse [3H]-thymidine puisse détecter la synthèse de l’ADN, cette méthode est une mesure indirecte de la division cellulaire, car la synthèse de l’ADN peut initier indépendamment de la mitose (c.-à-d. pendant la duplication génétique et l’apoptose1). Cette question est aggravée par le fait que la prolifération des cellules spécifique à l’antigène peut entraîner une apoptose considérable2, conduisant à une surestimation potentielle de la prolifération spécifique à l’antigène. En outre, la méthode [3H]-thymidine ne fournit pas d’informations phénotypiques pour les lymphocytes proliférants, tels que la prolifération des lignées CD4 ou CD8 dans les PBMC stimulées par des peptides antigéniques.
En 2003, nous avons publié le premier essais de dilution de colorant utilisant CFSE, appelé l’assay de prolifération basé sur CFSE3,4. CFSE est un colorant fluorescent qui se lie de façon stable aux protéines intracellulaires en formant un lien covalent avec les résidus intracellulaires de lysine. Puisque les protéines labellées CFSE sont divisées également entre les cellules filles3, les cellules qui se sont divisées peuvent être distinguées des cellules indivises par cytométrie de flux, qui permet également le phénotypage quantitatif des populations de lymphocytes. En effet, le nombre de divisions qu’une cellule a subies depuis le moment de la coloration DE la SCEPeut peut être mesuré à un certain degré5. Plus récemment, de nombreux colorants similaires tels que CellTrace Violet proliferation dye (VPD) et CytoTrack colorant ont été développés, qui fonctionnent d’une manière similaire6. Ce protocole met l’accent sur l’ESFC, mais les principes s’appliquent également à d’autres colorants connexes.
La coloration des tétramères Peptide-MHC est une méthode largement utilisée pour détecter et clonage des cellules CD8et T spécifiques à l’antigène. Il s’agit d’une méthode bien établie7,8,9,10; cependant, le clonage à base de tétramères exige une connaissance existante de la restriction de l’épitope/MHC et chaque épitome nécessite son propre tétramer11, ce qui limite la portée de la découverte et du clonage de nouvelles cellules T spécifiques à l’épitopène. La prolifération à base de CFSE peut être utilisée avec des peptides, des protéines ou des lysates cellulaires. Le protocole décrit ci-dessus est à la fois simple et robuste, et les cellules CD4et T qui répondent peuvent être triées pour être utilisées dans les tests de caractérisation fonctionnelle et biochimique en aval12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La prolifération à base de CFSE est une méthode simple et robuste pour détecter et énumérer les cellules CD4et T humaines spécifiques à l’antigène. Il a déjà été démontré que l’utilisation de la concentration optimale de CFSE est essentielle pour des résultats optimaux4. Trop de CFSE abroge la prolifération, alors que trop peu ne permet pas de distinguer les cellules divisées et indivises. En revanche, des concentrations relativement élevées (5,0 M) de CFSE sont util…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par : La Fondation de recherche sur le diabète juvénile [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Le National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Operational Infrastructure Support Program of the Victorian Government (S. M., A. D., E. T., M. S.), et NHMRC Bourse d’études supérieures APP1094337 et Bourse de doctorat de la FRDJ (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
Referencias
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