Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo
Summary
Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.
Abstract
In tutti gli animali, l’immunità innata fornisce un immediato e robusta difesa contro un ampio spettro di agenti patogeni. Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono i rami principali dell’immunità innata, e molti dei fattori che regolano queste risposte sono evolutivamente conservate tra gli invertebrati e mammiferi. Fagocitosi, il componente centrale di immunità innata cellulare, viene effettuata da cellule di sangue specializzate del sistema immunitario. Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un potente modello genetico per studiare i meccanismi molecolari e fisiologici degli impatti della fagocitosi in animali interi. Qui dimostriamo un test di fagocitosi in vivo basati su iniezione per quantificare l’assorbimento delle particelle e la distruzione di cellule del sangue di Drosophila , emociti. La procedura permette ai ricercatori di controllare con precisione la concentrazione di particelle e la dose, che permette di ottenere risultati altamente riproducibili in un breve lasso di tempo. L’esperimento è quantitativa, facile da eseguire e può essere applicato per schermo per fattori ospite che influenza patogeno riconoscimento, assorbimento e liquidazione.
Introduction
Difese immunitarie innate formano la prima linea di difesa contro i microbi patogeni. Queste risposte possono essere diviso funzionalmente in immunità innata umorale e cellulare, entrambi i quali sono mediati da recettori di riconoscimento modello germinale-codificato (PRRs) che senso pathogen-associated molecular pattern (PAMP)1. Molte delle vie di segnalazione e meccanismi effettori dell’immunità innata sono conservati nei mammiferi e invertebrati, come il nematode, elegans di Caenorhabditis e la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster2. Moscerino della frutta è emerso come un potente sistema di difesa dell’ospite contro microrganismi infettivi3di studiare. Drosophila è geneticamente trattabile, facilmente ed a buon mercato allevati nei laboratori e ha un tempo di generazione breve. Inoltre, la Mosca della frutta esibisce altamente efficienti difese contro una matrice di microbi, che consente l’esame dell’immunità ospite contro gli agenti patogeni virali, batterici, fungini o parassitari.
Drosophila immunologi hanno storicamente utilizzato avanti schermi genetici, genoma mediata da RNA interferenza (RNAi) proiezione di linee cellulari di insetto e pre-esistente ceppi mutanti volare per esaminare l’immunità innata – che conduce la identificazione e caratterizzazione di diverse vie immuni umorali evolutivamente conservati4,5,6,7,8. La risposta immunitaria innata umorale è, senza dubbio, il migliore caratterizzata difesa immunitaria nei moscerini della frutta. A seguito di infezione, la risposta umorale conduce alla produzione e rilascio sistemico di peptide antimicrobico molecole (AMP) nell’emolinfa, il sangue equivalente negli insetti. Amplificatori sono prodotte da pedaggio altamente conservata e Imd vie di segnalazione. La via di pedaggio è omologo al mammifero segnalazione del ricevitore TLR/IL-1R e pathway Imd è omologo alla segnalazione di fattore di necrosi tumorale-alfa dei mammiferi. In Drosophila, pedaggio segnalazione è indotto da batteri Gram-positivi e funghi Drosophila X virus6,9,10 e Imd segnalazione è indotta da batteri gram-negativi11 ,12.
Immunità cellulare, composto di incapsulamento, melanizzazione e fagocitosi dei patogeni invasivi, eseguiti da cellule specializzate del sangue chiamate emociti13. Ci sono tre classi di emociti nel moscerino della frutta: cristallo celle, lamellocytes e plasmatocytes13. Crystal cellule, che costituiscono il 5% degli emociti circolanti nelle larve, rilasciano enzimi proPhenoloxidase (proPO) che conduce la melanizzazione degli agenti patogeni e tessuti dell’ospite presso siti ferita. Lamellocytes, che non si trovano in embrioni sani o larve, sono cellule aderenti che incapsulano oggetti estranei. Queste cellule sono indotte su pupariation o quando parassitanti Vespa uova sono depositate nelle larve. Plasmatocytes fagocitaria, che compongono il 95% del circolante emociti nelle larve e tutti i rimanenti emociti negli adulti, gioca un ruolo nel rimodellamento durante lo sviluppo del tessuto e, in particolare, servire come cellula effettore principale della drosofila l’immunità cellulare.
Fagocitosi un’immediato e fondamentale linea di difesa immunitaria innata; i microbi che violano la barriera epiteliale di host sono rapidamente inghiottiti ed eliminati dalle cellule fagocitiche del sangue (per una rassegna completa di biologia delle cellule della fagocitosi vedere riferimento 14). Questo processo è iniziato quando il riconoscimento di pattern con codifica germline recettori (PRRs) su emociti riconoscono patogeni associati pattern molecolari (PAMPs) di microbi. Una volta legato ai loro target, PRRs avviare cascate di segnalazione che portano alla formazione di pseudopodi attraverso actina citoscheletrica rimodellamento. Pseudopodi circondano il microbo, che successivamente viene inghiottito e interiorizzato in un organello nascente phagosome. I microbi sono distrutti come phagosome subisce il processo di maturazione del fagosoma quando phagosome è trafficata verso l’interno degli emociti e acidifica attraverso una serie di interazioni con i lisosomi. In vitro e cella studi di biologia in cellule di mammifero primario sono stati strumentali nell’identificazione e caratterizzazione di fattori che regolano la fagocitosi, come il ricevitore di Fc-gamma dei mammiferi e C3b recettori15,16. Tuttavia, la possibilità di eseguire grandi schermi o studi in vivo sono limitati nei sistemi mammiferi.
Qui presentiamo un test in vivo per la fagocitosi in adulti mosche della frutta, che si basa su una procedura introdotta dal laboratorio di David Schneider nel 200017. Il laboratorio di Schneider ha mostrato che sessile emociti cluster lungo il vaso dorsale addominale prontamente fagocitare batteri e perle di polistirolo. Per visualizzare la fagocitosi, mosche sono iniettati con fluorescente contrassegnate particelle (come e. coli etichettati con isotiocianato di fluorescina (e. coli –FITC)), incubate per 30 minuti permettere emociti di fagocitare le particelle e poi iniettato con trypan blu, che disseta la fluorescenza delle particelle non phagocytosed durante il periodo di incubazione. Volare navi dorsale sono quindi Imaging utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza. Questa carta seminale, utilizzando un esperimento relativamente semplice, ha dimostrato che emociti fagocitare batteri e granuli di lattice, che fagocitosi batterica possono essere inibite iniettando pre-Vola con granuli di lattice, e che vola senza sia cellulare ed umorale le risposte immunitarie sono suscettibili anche di e. coli. L’analisi presentata in questo rapporto si basa sul lavoro del laboratorio Schneider per quantificare in vivo fagocitosi misurando l’intensità della fluorescenza delle particelle inghiottito da emociti vaso dorsale associato.
Simile all’approccio adottato nei sistemi mammiferi, Drosophila genetisti inizialmente utilizzato genoma schermi RNAi in vitro per identificare i geni richiesti per la risposta immunitaria cellulare18,19,20 ,21,22,23. Tuttavia, lo sviluppo del dosaggio adulto fagocitosi in vivo attivato follow-up esperimenti per essere prontamente effettuati in animali interi, consentendo ai ricercatori di verificare il biologico il ruolo dei fattori individuati negli studi in vitro. Tale era il caso con il recettore transmembrana Eater, che è stato prima identificato come un recettore batterico in un schermo di RNAi utilizzando S2 cellule24 e poi più tardi mostrato a mediare Escherichia coli (Escherichia coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitosi di Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) in adulti25.
Il nostro laboratorio impiegato il test di fagocitosi in vivo in avanti schermi genetici e studi di associazione genome-wide (usando il pannello di riferimento genetico drosofila (DGRP)) per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi in adulti emociti. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione i recettori PGRP-SC1A e PGRP-SA26, la vescicola intracellulare traffico proteina Rab1427, il trasportatore del glutammato Polifemo28e RNA-proteina Fox-129.
Anticipiamo che futuri schermi che incorporano la fagocitosi in vivo potrebbero portare all’identificazione di ulteriori geni che sono importanti per la risposta immunitaria cellulare in drosofila. Schermate mediante linee inbred completamente sequenziato, ad esempio la DGRP o la drosofila sintetico popolazione risorsa (DSPR), possono identificare varianti naturali che influenzano lo sviluppo di fagocitosi o emociti. Inoltre, la tecnica potrebbe essere adottata in altre specie di Drosophila o utilizzata per nuove risorse comunitarie di schermo, ad esempio la raccolta di 250 specie di Drosophila mantenuto dal National Drosophila specie Stock Center (NDSSC ) alla Cornell. Questi esperimenti possono essere effettuati utilizzando fluorescente etichettati batteriche o fungine-parete bioparticelle che sono commercialmente disponibili o possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi numero di specie batteriche o fungine – fornito che il microbo esprime marcatori fluorescenti .
Protocol
Representative Results
Discussion
Commercialmente disponibile, fluorescente contrassegnate particelle sono utilizzate per valutare la fagocitosi in generale (0,2 µm per volta carbossilato microsfere) o fagocitosi dei microbi (calore – fluorescente etichettati o chimicamente uccisi batteri o lieviti). Per valutare la maturazione del fagosoma, i ricercatori possono selezionare particelle marcate con un colorante di pH-sensibile che reagisce in quando il pH si abbassa da neutro ad acido, come il phagolysosome. In alternativa, per esaminare i p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Beth Gonzalez e Dr. Aprajita Garg per supporto nello svolgimento degli esperimenti in vivo fagocitosi. Una sovvenzione di seme di NSF UMD ADVANCE e UMD NIH T32 borse per la formazione, cellula e biologia molecolare (CMB) e le interazioni ospite-patogeno (HPI), finanziato quest’opera.
Materials
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
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