Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano
Summary
El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.
Abstract
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo el embrión de la etapa de gastrula del anthozoiano cnidario Nematostella vectensis sin sacrificar la vida del animal. Después de la fertilización in vitro y la desgelatina, se permite que los cigotos se desarrollen durante 24 horas a temperatura ambiente para llegar a la etapa de gastrula temprana a media. Los embriones de gastrula se colocan en un lecho de gel de agarosa en un plato de Petri que contiene agua de mar. Bajo el microscopio de disección, se utiliza una aguja de tungsteno para separar quirúrgicamente un fragmento de tejido abortivo de cada embrión. Los embriones post-cirugía se les permite sanar y continuar el desarrollo. El ADN genómico se extrae del fragmento de tejido aislado y se utiliza como plantilla para PCR específico del locus. El genotipo se puede determinar en función del tamaño de los productos PCR o de la presencia/ausencia de productos PCR específicos de alelos. Los embriones post-cirugía se clasifican según el genotipo. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a examinar, pero requiere mínimamente 4-5 h. Este método se puede utilizar para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de embriones y permite analizar fenotipos durante el desarrollo.
Introduction
Los cnidarios representan un grupo diverso de animales que incluyen medusas, corales y anémonas de mar. Son diploblasts, compuestos de ectodermo y endoderm que están separados por una matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria es un grupo hermano de la especia bilateria, al que pertenecen1. modelos animales tradicionales como Drosophila y Mus. Además, se cree que la divergencia Cnidaria-Bilateria ocurrió en el período pre-Cambriano2. Como tal, los estudios comparativos de cnidarios y bilaterianes son esenciales para obtener información sobre la biología de su ancestro común más reciente. Recientemente, la genómica comparativa ha revelado que los cnidarios y bilaterianes comparten muchos genes del kit de herramientas del desarrollo como la muesca y la bHLH, lo que implica que su ancestro común ya tenía estos genes3. Sin embargo, el papel de estos genes del conjunto de herramientas de desarrollo en el último ancestro común de Cnidaria y Bilateria es comparativamente menos bien entendido. Para abordar este problema, es fundamental estudiar cómo funcionan estos genes profundamente conservados en los cnidarios.
Uno de los modelos genéticos cnidarios emergentes es el antozoiano Nematostella vectensis. Su genoma hasido secuenciado 3, y una variedad de herramientas genéticas, incluyendo el derribo genético mediado por morpholino, la transgénesis mediada por meganucleasas y los knockins y knockouts de genes mediados por CRISPR-Cas9, ahora están disponibles para su uso en este animal. Además, el desarrollo de Nematostella es relativamente bien entendido. Durante la embriogénesis, la gastrulation se produce por invaginación4,y el embrión se convierte en una larva de planula de natación libre. La planula posteriormente se transforma en un pólipo sésil con boca y tentáculos circunportales. El pólipo entonces crece y alcanza la madurez sexual.
La mutagénesis dirigida mediada por CRISPR-Cas9 se utiliza ahora de forma rutinaria para estudiar la función génica en Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Para generar mutantes noqueadores en Nematostella, un cóctel que contiene ARN de una sola guía específicos de locus y la proteína endonuclease Cas9 se inyecta primero en huevos no fertilizados o fertilizados para producir animales fundadores de F0 que normalmente muestran Mosaicism. Los animales F0 son posteriormente elevados a la madurez sexual y cruzados entre sí paraproducir una población de F1, un subconjunto de los cuales pueden ser mutantes nocaut 6. Alternativamente, los animales F0 sexualmente maduros se pueden cruzar con animales de tipo salvaje para generar animales heterocigotos F1, y los heterocigotos F1 que llevan un alelo knockout en el locus de interés se pueden cruzar entre sí para producir descendencia F2, una cuarta parte de los cuales se espera que sean mutantes nocaut5. Ambos enfoques requieren un método para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea. Los tentáculos de pólipos se pueden utilizar para extraer ADN genómico para el genotipado6,7. Sin embargo, en los casos en que se está investigando la función de desarrollo del gen de interés y los embriones mutantes no alcanzan la etapa de pólipos (es decir, debido a la letalidad larvaria asociada con la mutación), los mutantes noqueantes deben ser identificados al principio de la ontogenia. Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo de animales individuales en la etapa de gastrula sin sacrificar al animal, que permite la identificación de mutantes noqueadores de una población genéticamente heterogénea de embriones. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a ser examinados, pero requiere mínimamente 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo un solo embrión de anémonas de mar sin sacrificar al animal. Después del desove y la desgelatina, los huevos fertilizados se pueden convertir en gastrulas. La región aborta de cada embrión de gastrula se extrae quirúrgicamente, y el tejido aboral aislado se utiliza para la extracción genómica posterior de ADN, mientras que los embriones post-cirugía restantes sanan y continúan el desarrollo. Los extractos de ADNG se utilizan para un ensayo de PCR para d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los revisores anónimos por los comentarios sobre la versión anterior del manuscrito, que mejoró el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
Referencias
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