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Inmunología y contagio

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

Published: June 24, 2019
doi:
10.3791/59537
, , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Rochester Medical Center, 2Department of Molecular and Cell Biology,Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus Universidad Autónoma de Madrid

Summary

La récente épidémie de virus Zika souligne l’importance d’établir des approches génétiques inversées pour mettre au point des vaccins et/ou des stratégies thérapeutiques. Ici, nous décrivons le protocole pour sauver un virus Zika recombinant infectieux d’un clone d’ADNc pleine longueur assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain de cytomégalovirus immédiatement-tôt.

Abstract

L’association de l’infection par le virus Zika (ZIKV) par des complications neurologiques lors de la récente flambée mondiale et l’absence de vaccins et/ou d’antiviraux approuvés ont souligné la nécessité urgente de développer des systèmes génétiques inversés ZIKV pour faciliter l’étude de la biologie de ZIKV et le développement des approches thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cependant, comme avec d’autres flavivirus, la génération de clones d’ADNc infectieux de ZIKV a été entravée en raison de la toxicité des séquences virales pendant son amplification dans les bactéries. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une approche non traditionnelle basée sur l’utilisation de chromosomes artificiels bactériens (BAC). Grâce à cette approche, la copie intégrale de la souche DE l’ADNc de la souche ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) est générée à partir de quatre fragments d’ADN synthétiques et assemblée dans le plasmide pBeloBAC11 à une seule copie sous le contrôle du cytomégalovirus humain (CMV) promoteur immédiat-précoce. Le clone d’ADNc BAC assemblé est stable pendant la propagation chez les bactéries, et le recombinant infectieux (r)ZIKV est récupéré dans les cellules Vero après transfection du clone de l’ADNc BAC. Le protocole décrit ici fournit une technique puissante pour la génération de clones infectieux de flavivirus, y compris ZIKV, et d’autres virus de l’ARN à brin positif, en particulier ceux avec de grands génomes qui ont des problèmes de stabilité pendant les bactéries propagation.

Introduction

ZIKV est un membre transmis par les moustiques du genre Flavivirus au sein de la famille Flaviviridae qui constitue actuellement une urgence de santé publique mondiale1. Comme d’autres flavivirus, le ZIKV est un virus à ARN enveloppé avec une structure icosahedral-like qui contient un sens positif, molécule d’ARN à brin unique d’environ 10,8 kb (Figure 1)2. Le génome viral code une grande polyprotéine d’environ 3 423 acides aminés qui est traitée par des protéases virales et cellulaires en trois protéines structurelles (capsid [C], prémembrane/membrane [prM/M] et enveloppe [E]) qui sont impliquées dans la formation de la particules virales et sept protéines non structurelles (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5) qui participent à la réplication du génome, à l’assemblage du virus et à l’évasion de la réponse immunitaire de l’hôte (figure 1)3.

Historiquement, l’infection de ZIKV a été associée à une maladie fébrile douce4,5. Cependant, la pandémie explosive récente d’infections à ZIKV dans toute l’Amérique du Sud et centrale, le Pacifique Sud et les Caraïbes6,7,8, et son association avec l’apparition du syndrome de Guillain-Barré et la microcéphalie9,10,11,12,13, ont changé la perception historique et potentialisé la pertinence de ZIKV comme un agent pathogène humain important. En ce sens, le développement d’outils moléculaires, tels que les clones infectieux d’ADNc, facilitera l’étude de la pathogénie virale et le développement de vaccins génétiquement définis et l’identification de médicaments antiviraux pour le traitement de l’infection à ZIKV. Comme décrit pour d’autres flavivirus, la génération de clones infectieux ZIKV est difficile en raison de la présence de promoteurs bactériens cryptiques dans le génome viral14 qui permettent l’expression de fuite de protéines virales toxiques lors de la propagation de la cDNA clones dans les bactéries en utilisant standard de haute copie-nombre plasmides15,16,17. Pour surmonter ce problème de toxicité, plusieurs approches non traditionnelles ont été mises en œuvre avec succès au cours des deux dernières années18. Il s’agit notamment de l’utilisation de plasmides à faible nombre de copies19,20, l’insertion d’intrones pour perturber les régions toxiques21,22,23, la ligature in vitro des fragments d’ADNc 24 Ans, états-unis , 25, silençage mutationnel des promoteurs bactériens cryptiques présents dans le génome viral26,27, amplicons sous-génomiques infectieux (ISA)28,29, la méthode d’assemblage Gibson30 , et l’utilisation de la réaction circulaire d’extension de polymérase (CPER)31.

Ici, nous décrivons le protocole détaillé pour l’ingénierie d’un clone d’ADNc pleine longueur de la souche ZIKV ZIKV-RGN13, en utilisant un BAC pour surmonter le problème de toxicité, et le sauvetage de rZIKV infectieux par transfection directe du clone d’ADNc BAC en Vero cellules32, une lignée cellulaire approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) pour le développement de vaccins humains33. Dans ce système, la copie intégrale de l’ADNc du génome viral est assemblée dans le plasmide BAC pBeloBAC1134 (Figure 2A), un plasmide à faible copie (une à deux copies par cellule) dérivé du facteur F35d’Escherichia coli , qui minimise la toxicité des séquences de flavivirus lors de sa propagation dans les bactéries. L’ADNc du génome zikV est assemblé en pBeloBAC11 sous le contrôle du promoteur humain CMV immédiatement-tôt, pour permettre l’expression de l’ARN viral (v) dans le noyau des cellules transfectées par la polymérase d’ARN cellulaire II, et flanqué à la 3′-extrémité par l’hépatite virus du delta (HDV) ribozyme (RZ), suivi par les séquences de l’hormone de croissance bovine (BGH) de terminaison et les signaux de polyadenylation pour produire des ARN synthétiques portant authentique5′- et 3′-extrémités du génome viral, respectivement (Figure 2B). Ce système cDNA-lancé a comme conséquence l’expression intracellulaire de l’ARN viral plafonné, permettant le rétablissement du ZIKV infectieux sans avoir besoin d’une étape de transcription in vitro. L’approche BAC fournit une méthodologie puissante applicable à la construction de clones d’ADNc infectieux stables et entièrement fonctionnels pour d’autres flavivirus, ainsi que d’autres virus de l’ARN à brin positif36,37, 38,39,40,41.

Protocol

1. Construction d’un clone d’ADNc infectieux ZIKV dans un BAC REMARQUE: La stratégie pour l’assemblage de ZIKV dans les BAC est décrite pour la souche13 du RGN (numéro d’adhésion KU527068) (Figure 2). Sélectionnez des sites de restriction uniques convenablement espacés dans le génome viral qui sont absents dans le plasmide pBeloBAC11 (Figure 2A).REMARQUE: Pour ZIKV-RGN, les sites de restriction Pml I, Afe I et BstB I (positions génomiques 3 347, 5 969 et 9 127, respectivement) ont été sélectionnés. Dans le cas où aucun site de restriction approprié n’est disponible dans le génome viral, générer de nouveaux sites de restriction en introduisant des mutations muets nucléotides dans le génome viral au cours de la conception du fragment d’ADNc. Générer par synthèse chimique quatre fragments d’ADNc couvrant le génome intégral (Z1 à Z4), flanqués du promoteur cMV à l’extrémité 5′-extrémité et le HDV RZ, la terminaison BGH, et les séquences de polyadenylation à la 3′-extrémité ( Figure 2B). Chaque fragment doit être flanqué des sites de restriction sélectionnés (étape 1.1).REMARQUE: Fragment Z1 est utilisé comme une colonne vertébrale pour cloner le reste des fragments dans le pBeloBac11. Pour cela, il doit contenir le promoteur humain CMV et doit être flanqué à la 5′-fin par ApaL I (pour cloner ce fragment en pBeloBAC11) et Asc I (absent dans le génome viral), et à la 3′-extrémité par les sites de restriction sélectionnés pour l’assemblage du clone infectieux (Pml I , Afe I, et BstB I) suivis de Mlu I (absent dans le génome viral) et BamH I (pour cloner ce fragment en pBeloBAC11). Le fragment Z4 doit contenir la région génomique du dernier site de restriction sélectionné (BstB I) jusqu’à la fin du génome viral, suivi du HDV RZ, de la terminaison de BGH et des séquences de polyadenylation, et du site de restriction Mlu I (figure 2B). Alternativement, les fragments d’ADNc (Z1-Z4) pourraient être générés par une combinaison de réactions standard de la chaîne de polymériase de transcriptase inverse (RT-PCR) et de PCR qui se chevauchent à l’aide d’oligonucléotides spécifiques. Assembler le clone infectieux de l’ADNc par clonage séquentiel des fragments Z1 à Z4 en pBeloBAC11 (Figure 2B). Digdez le plasmide pBeloBAC11 et le fragment Z1 avec ApaL I et BamH I. Pour cela, mélanger 2 g de plasmide pBeloBAC11 ou 1 g de fragment de Z1 avec 10 oL de tampon de réaction 10x, 20 unités de chaque enzyme, et de l’eau pour atteindre un volume final de 100 oL. Incubate à 37 oC pendant 2 h. Déphosphoryler le vecteur BAC à l’aide de la phosphatase alcaline de crevette (SAP). À cette fin, ajouter 2,5 L (2,5 unités) de SAP au BAC digéré et incuber à 37 oC pendant 1 h. Inactiver le SAP par incubation à 75 oC pendant 15 min. Purifiez le vecteur BAC déphosphoryé et le fragment Z1 par l’électrophorèse de gel d’agarose à l’aide d’un kit commercial de nettoyage de gel optimisé pour la purification des fragments d’ADN de plus de 10 kb (voir le Tableau des matériaux). Effectuer la réaction de ligature pour générer le plasmide (p)BAC-Z1. À cette fin, mélangez 150 ng de vecteur BAC purifié digéré avec l’insert purifié à l’aide d’un rapport molaire de vecteur-à-insert de 1:3, 1,5 l de tampon de ligase d’ADN T4 de 10 x T4 contenant 10 mM D’ATP, une unité de ligase d’ADN T4, et de l’eau à un volume final de 15 l. Incuber le mélange de ligature pendant 20 h à 16 oC. Comme contrôle de la réaction de ligature, effectuer en parallèle une réaction de ligature sans insertion. Inactiver la ligase par incubation à 65 oC pendant 15 min.REMARQUE: Dans le cas des AIN émoussés, incuber la réaction de ligature pendant 20 h à 14 oC. En raison de la grande taille du vecteur BAC (Figure 2A), il est essentiel d’utiliser de plus grandes quantités de vecteur et d’insertion que les ligations à l’aide de plasmides conventionnels afin d’augmenter l’efficacité de la ligature. Transformer 50 l de cellules électrocompétentes E. coli DH10B avec 2 l de la réaction de ligature (étape 1,3,5) par électroporation (25 oF de capacitance, 2,5 kV et 100 degrés de résistance), à l’aide de cuvettes d’électroporation équipées d’électrodes espacées à des intervalles de 0,2 cm, selon les protocoles standard. Transférer les cellules dans un tube de polypropylène avec 1 ml de SOC moyen (2% tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 0,05 % de NaCl, 2,5 ml de KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMg MgSO4, 20 mM de glucose [pH 7,0]) et les incuber à 37 oC pendant 1 h avec des secousses douces (200-250 tr/min). Déposer les cellules sur des plaques d’agar de bouillon de Luria (LB) contenant 12,5 g/mL de chloramphenicol et les incuber à 37 oC pendant 16 h. Choisissez de 8 à 12 colonies bactériennes, faites une réplique sur une plaque d’agar LB fraîche contenant 12,5 g/mL de chloramphenicol, et testez si elles contiennent l’insert correct par analyse directe de PCR utilisant des oligonucléotides spécifiques. Choisissez une colonie positive à partir de la plaque réplique, cultivez-la en 100 ml de LB contenant 12,5 g/mL de chloramphenicol, et isolez l’ADNc BAC par la méthode de lyse alcaline à l’aide d’un kit midi plasmique commercial, suivant la recommandation de purification des plasmides à faible copie (voir le Tableau des matériaux).REMARQUE: L’ADNc BAC préparé par cette méthode peut être contaminé avec jusqu’à 30% de l’ADN génomique bactérien, mais il convient dans la qualité pour effectuer l’analyse de restriction, le séquençage, et le clonage. Selon la taille de l’alcoolémie, on peut obtenir des rendements de 4 à 6 g du plasmide BAC. Vérifier l’intégrité génétique de l’ADNc cloné par l’analyse de restriction. Digest 500 ng du plasmide pBAC-Z1 avec Asc I et Pml I à 37 oC pendant 1 h et confirmer la présence du fragment z1 par électrophorèse de gel. Pour confirmer davantage que les mutations indésirables n’ont pas été introduites, séquencez l’insert avec des oligonucléotides spécifiques. À partir du plasmide pBAC-Z1 contenant les sites de restriction sélectionnés (Pml I, Afe I, BstB I et Mlu I), clonent séquentiellement des fragments Z2 à Z4 pour générer le clone infectieux pBAC-ZIKV (Figure 2B), suivant des éléments expérimentaux similaires approches décrites ci-dessus pour le fragment Z1 (étapes 1.3.1-1.3.10). 2. Préparation de la haute pureté pBAC-ZIKV pour le sauvetage de rZIKV infectieux REMARQUE: La préparation à grande échelle d’un clone infectieux ultrapure pBAC-ZIKV, adapté à la transfection et au sauvetage des virus infectieux, est réalisée par lyse alcaline avec un kit commercial spécialement développé pour la purification BAC (voir le tableau de Matériaux). Le kit doit inclure une étape de digestion d’exonucléase dépendante de l’ATP qui élimine la contamination bactérienne de l’ADN génomique, permettant l’isolement de l’ADNc BAC avec une qualité de pureté similaire à celle obtenue avec la méthode du chlorure de césium. Cultivez une seule colonie de E. coli DH10B portant le clone infectieux pBAC-ZIKV dans 5 ml de milieu LB contenant 12,5 g/mL de chloramphenicol à 37 oC pendant 8 h avec des secousses douces (200-250 tr/min). Ajouter 1 ml de culture bactérienne (étape 2,1) à 500 ml de LB avec 12,5 g/mL de chloramphenicol dans un flacon de 2 L et faire pousser les cellules à 37 oC pendant 14-16 h (jusqu’à ce qu’un OD600 de 0,6-0,8).REMARQUE: Les bouillons riches, tels que le Broth Terrible (TB), peuvent produire des densités cellulaires extrêmement élevées, ce qui entraîne un rendement plus faible et moins de pureté de l’ADNc BAC. Purifier le clone infectieux d’ADNc BAC par lyse alcaline à l’aide d’un kit commercial spécialement développé pour la purification BAC, selon les spécifications du fabricant (voir le Tableau des matériaux). Maintenir l’ADNc BAC purifié à 4 oC. Selon la taille du BAC, on peut obtenir des rendements de 30 g de clone d’ADNc BAC ultrapur.REMARQUE: Ne pas sécher la pastille d’ADN pendant plus de 5 min, car le séchage excessive rendra difficile la dissolution de l’ADNc BAC. En raison de la grande taille du clone d’ADNc BAC, évitez le vortexing ou le tuyauterie pour empêcher le cisaillement plasmide. 3. Sauvetage de rZIKV infectieux du clone d’ADNc BAC par transfection des cellules Vero REMARQUE: Le rZIKV infectieux est récupéré par la transfection des cellules Vero avec le clone d’ADNc pBAC-ZIKV, à l’aide d’un réactif commercial de transfection lipidique cationique (voir le Tableau des matériaux; Figure 3). Un jour avant la transfection, plaquesur 6 plaques de puits 5 x 105 cellules Vero/bien dans le milieu de croissance (le milieu d’aigle modifié de Dulbecco [DMEM] complété par 5% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM L-glutamine, et 1% d’acides aminés non essentiels) sans antibiotiques pour soulever 90% de monocouches de cellules confluentes au moment de la transfection.REMARQUE: Nous vous recommandons d’effectuer les sauvetages de virus dans les triplicats. Moyenne equilibrate à teneur réduite en sérum (voir le tableau des matériaux) à température ambiante et préparation des mélanges de transfection dans des tubes de microfuge stériles pour chaque échantillon de transfection comme suit. Ajouter 4 g de clone d’ADNc BAC dans 250 l de milieu sérique réduit et mélanger soigneusement, en évitant le vortexing pour empêcher le cisaillement plasmide. Dans un tube séparé, diluer 12 l de réactif de transfection (1 mg/mL) (voir le tableau des matériaux) dans 250 l de milieu sérique réduit, mélanger par vortex et couver à température ambiante pendant 5 min. Mélanger l’ADNc BAC dilué et le réactif de transfection (avec un rapport de 1:3 de réagent D’ADN: transfection), mélanger soigneusement tout en évitant le vortex, et couver à température ambiante pendant 20-30 min. Pendant la période d’incubation du mélange de réactifditoym/transfection de BAC, lavez les cellules de Vero avec le milieu de croissance sans antibiotiques et laissez les cellules dans 1 ml de milieu frais sans antibiotiques.REMARQUE: L’ajout d’antibiotiques pendant le processus de transfection peut diminuer l’efficacité de la transfection. Distribuer dans le sens déroulant les 500 ll du mélange de réagent d’ADNc/transfection BAC (de l’étape 3.2.3) sur les cellules Vero, les mélanger en berçant la plaque d’avant en arrière, et incuber les cellules dans un incubateur humidifié de 5 % de CO2 à 37 oC pendant 6h. Retirer le milieu de transfection, ajouter 2 ml de milieu de croissance frais avec des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 og/mL de streptomycine), incuber les cellules dans un incubateur humidifié CO2 à 37 oC, et vérifier chaque jour l’induction de l’effet cytopathique (CPE ).REMARQUE: LE CPE de ZIKV est tout à fait prononcé dans les cellules de Vero et il est caractérisé par la présence des cellules arrondies et birefringentes qui détachent et flottent dans le supernatant de culture de tissu. Recueillir des aliquots (100 l) des supernatants de culture tissulaire vero (étape 3.5) tous les 24 heures pour déterminer l’efficacité de la récupération du virus en évaluant la présence de ZIKV à l’aide d’un test de plaque standard sur les cellules Vero fraîches (figure 4A). Après quatre à six jours de transfection, lorsque le CPE est d’environ 50%-75% (Figure 4B), recueillir les supernatants de culture tissulaire dans des tubes coniques de 15 ml et centrifugeuse à 2.000 x g pendant 10 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires. Récoltez les supernatants contenant du rZIKV et jetez les granulés de cellules. Aliquot le supernatant dans des cryotubes et les stocker à -80 oC pour confirmer davantage la présence de rZIKV secouru. 4. Titration de rZIKV récupéré Un jour avant la titration, graines sur des plaques de 12 puits 2,5 x 105 cellules Vero/puits dans le milieu de croissance pour soulever des monocouches de cellules confluentes de 90 % au moment de la titration.REMARQUE: Nous vous recommandons de procéder à la titration du rZIKV récupéré dans les tripliciats. Retirer un aliquot du supernatant du congélateur (étape 3.8) et faire des dilutions série11 10 fois dans le milieu de croissance sans FBS. Laver les cellules Vero 2x avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et ajouter 200 L/puits de chaque dilution virale dans le triple. Placer les plaques dans un incubateur humidifié co2 à 37 oC et les roches toutes les 15 min pendant une période d’adsorption de 90 min. Retirez l’inoculum viral, superchez les cellules avec 2 ml de milieu de croissance contenant 2 % de FBS, 1 % de DEAE-dextran et 0,6 % d’Agar Noble, et incubez à 37 oC sous 5 % de CO2 pendant 3 à 4 jours.REMARQUE: Il est possible d’utiliser l’agarose, la méthylcellulose ou d’autres supports de recel. Le temps de formation de la plaque appropriée varie en fonction de la pariation utilisée et de la souche ZIKV. Fixez les cellules infectées par le ZIKV avec 1 ml/puits de 4 % de formaldéhyde dilué dans le PBS à température ambiante pendant 1 h, retirez la superposition et visualisez les plaques virales en les tachant avec 0,1 % de violette cristalline dans 20 % de méthanol à température ambiante pendant 15 min. Jeter la violette de cristal, laver 3x avec de l’eau, laisser sécher les plaques et compter manuellement les plaques (figure4C, panneau gauche). Le titre viral est calculé sous forme d’unités de formation de plaque par millilitre (PFU/ml). Alternativement, les plaques virales peuvent être visualisées par immunostaining avec l’anticorps monoclonal de souris de protéine De-flavivirus E (mAb) 4G2 (figure4C,panneau droit). Pour évaluer les plaques ZIKV par immunostaining, après la fixation et l’enlèvement de la gélose de superposition comme décrit ci-dessus (à l’étape 4.5), lavez les cellules 2x avec PBS et perméabilize par incubation avec 200 L/puits de 0,5% Triton-X100 en PBS pendant 15 min à température ambiante. Retirez la solution de perméabilisation, lavez les cellules 3x avec du PBS et bloquez-les avec une solution de blocage de 200 l/puits (10 % de FBS en PBS) pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE: D’autres solutions de blocage standard (par exemple, 2,5 % de BSA en PBS) peuvent être utilisées à cette étape. Retirez la solution de blocage et incubez les cellules avec 200 l/puits de la protéine mAb 4G2 de la protéine pan-flavivirus E diluée dans la solution de blocage (1 g/mL) pendant 1 h à 37 oC.REMARQUE: D’autres anticorps mAb ou polyclonal (pAb) peuvent être utilisés au lieu de la 4G2 pour l’immunostaining et la détection des plaques virales. Laver les cellules 3x avec du PBS, et les incuber avec 200 l d’anticorps secondaire anti-souris biotinylated dilué (suivant la recommandation du fabricant) dans la solution de blocage pour 1 h à 37 oC. Retirez l’anticorps secondaire, lavez les cellules 4x avec du PBS et visualisez les plaques virales à l’aide d’un kit de peroxidase à base d’avidine/biotine suivant les spécifications du fabricant (voir le tableau des matériaux). 5. Confirmation du succès du sauvetage de rZIKV REMARQUE: Pour confirmer davantage l’identité du virus sauvé, l’expression de la protéine ZIKV E est analysée par immunofluorescence à l’aide de la souris mAb 1176-56 spécifique à la protéine ZIKV E (Figure 4D). Ce mAb est spécifique pour la protéine ZIKV E, contrairement à la situation du pan-flavivirus E protéine mAb 4G2 (étape 4.6.3). Alternativement, l’identité du virus peut être confirmée par le séquençage. Un jour avant l’analyse d’immunofluorescence, les couvertures de graine dans les plaques de 24 puits contenant 1 x 105 cellules de Vero/puits dans le milieu de croissance pour soulever des monocouches de cellules de confluent de 90% par le temps de l’infection. Laver les cellules 2x avec du PBS et les infecter avec une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 PFU/cellule du virus sauvé dans le milieu de croissance sans FBS (100 L/puits) en triple. Incuber les assiettes à 37 oC pendant 90 min. Après l’adsorption virale, retirez l’inoculum viral, ajoutez 0,5 ml de milieu de croissance frais avec 2 % de FBS, et incubez les cellules dans un incubateur humidifié co2 à 37 oC pendant 48 h. Enlever le supernatant de culture tissulaire, fixer les cellules avec 150 L/puits de 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 20 min à température ambiante, et perméabilize les cellules avec 150 L / puits de 0,5% Triton-X100 en PBS pendant 15 min à température ambiante. Après avoir enlevé la solution de perméabilisation et lavé les cellules 3x avec PBS, bloquer les cellules avec 150 l /puits de solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE: L’analyse cellulaire est bloquée par d’autres solutions de blocage (p. ex., 2,5 % de BSA dans PBS). Retirez la solution de blocage et incubez les cellules avec 100 l/puits de mAb 1176-56, spécifiques à la protéine ZIKV E, diluée dans la solution de blocage (1 g/mL) pendant 1 h à 37 oC. Laver les cellules 3x avec du PBS, les incuber à température ambiante pendant 1 h avec 100 l/puits d’anticorps secondaire anti-souris Alexa 488-conjugué dilué (suivant la recommandation du fabricant) dans la solution de blocage, laver les cellules intensivement avec PBS, et les incuber avec 150 l/puits de 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL) dilué 1:200 en PBS à température ambiante pendant 10 min. Laver les cellules 3x avec du PBS, monter les résilles sur un support de montage antifade (voir le tableau des matériaux),et analyser les échantillons sous un microscope à fluorescence.REMARQUE: Pour l’entreposage à long terme, entreposez les échantillons à 4 oC, à l’abri de la lumière. 6. Amplification et génération de stocks viraux REMARQUE: Une fois que l’identité du virus sauvé est confirmée (section 5), amplifiez le virus sur les cellules Vero et génèrent des stocks viraux pour d’autres études. Cultivez des cellules Vero dans des plaques de 100 mm x 21 mm à la confluence de 90 % et infectez-les avec un MOI de 0,1 PFU/cellule tel que décrit précédemment. Lorsque le CPE est d’environ 75 % (environ 48-72 h après l’infection), recueillir le supernatant de culture tissulaire dans un tube conique de 50 ml et centrifugeuse à 2 000 x g pendant 10 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires. Récoltez le supernatant contenant du rZIKV et jetez la pastille cellulaire. Aliquot le supernatant dans des cryotubes et les stocker à -80 oC. Retirez un virus aliquot du congélateur et déterminez le titre viral par l’analyse de la plaque tel que décrit précédemment (section 4).

Representative Results

Le protocole décrit ici permet la génération de clones infectieux cDNA complets ZIKV stables à l’aide d’un BAC pour minimiser les problèmes de toxicité associés à plusieurs séquences flavivirales. La récupération efficace du rZIKV infectieux du clone d’ADNc BAC peut être facilement réalisée après la transfection des cellules Vero sensibles (Figure 2). En utilisant ce protocole, nous avons généré un clone stable de cDNA pleine longueur de la souche ZIKV RGN32 en clonant séquentiellement quatre fragments de cDNA qui se chevauchent dans le plasmique BAC pBeloBAC1134 en utilisant des méthodes de clonage conventionnelles et uniques sites de restriction présents dans le génome viral (Figure 2). Le clone d’ADNc pleine longueur a été flanqué à l’extrémité 5′-extrémité par le promoteur humain de CMV pour permettre l’expression de vRNA dans le noyau des cellules transfectées, et à l’extrémité 3′-par le RZ de HDV suivi par les séquences de polyadenylation et de terminaison de BGH, pour produire des ARN contenant l’exact 3′-fin du génome viral (Figure 2). La stabilité des bactéries du clone d’ADNc BAC généré, ainsi que sa manipulation facile à l’aide de technologies d’ADN recombinant standard, met en évidence le potentiel de l’approche BAC cDNA pour la génération rapide et fiable de clones d’ADNc complet sédentaires de ZIKV et d’autres flavivirus ou virus à ARN à brin positif avec des génomes viraux instables. Une fois le clone d’ADNc BAC assemblé (Figure 2), le virus infectieux a pu être facilement récupéré après la transfection directe des cellules Vero sensibles avec le clone d’ADNc BAC à l’aide de liposomes cationiques(Figure 3). Ce système lancé par l’ADNc a permis l’expression intracellulaire de l’ARNrplafonné, permettant la récupération des virus infectieux sans avoir besoin d’une étape de transcription in vitro. Grâce à cette approche, nous avons pu sauver rZIKV-RGN avec des titers supérieurs à 106 PFU/mL à 5 jours après la transfection (figure 4A). De plus, le virus sauvé a induit un CPE clair (figure4B),a généré des plaques homogènes d’environ 2 mm de taille (figure4C),et son identité a été confirmée par le séquençage (données non indiquées) et l’analyse d’immunofluorescence à l’aide de l’analyse spécifique au mAb pour la protéine ZIKV E, 1176-56 (figure 4D). Les données in vitro indiquent que le rZIKV-RGN récupéré a été répliqué efficacement dans les cellules Vero et aux niveaux comparés à un isolat zikV naturel32 (données non montrées). Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le rZIKV infectieux peut être sauvé des clones d’ADNc completassemblés dans un BAC. Figure 1 : Organisation du génome ZIKV et structure virion. (A) Organisation du génome : LE ZIKV contient un ARN positif à brin unique qui se traduit par une seule polyprotéine. La polyprotéine traduite a été clivée par des protéases virales (flèches) et hôtes (diamants) pour produire les protéines structurelles capsid (C, bleu), matrice (M, brun), et enveloppe (E, vert), et sept protéines non structurelles (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, et NS5). Les régions non traduites (UTR) de 5′ et 3′ à la fin du génome viral sont indiquées avec des lignes noires. (B) Structure Virion : Les virions ZIKV ont été décorées avec les protéines E et M, ancrées dans une couche lipidique avec une structure icosahedral-like. Sous l’enveloppe virale était le nucléocapside viral composé de la protéine C liée à l’ARN génomique viral. Ce chiffre a été adapté à partir d’Ivila-Pérez et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Assemblage du clone d’ADNc infectieux ZIKV dans un BAC. (A) Représentation schématique du bac pBeloBAC11:Les gènes régulateurs parA, parB, parC, et repE, l’origine dela réplication f-facteur (OriS), le gène résistant au chloramphenicol (Cmr), et le lac Le gène Z sont indiqués. Les sites de restriction pertinents utilisés pour assembler le clone infectieux de l’ADNc ZIKV sont soulignés. (B) Assemblage du clone d’ADNc infectieux de ZIKV dans le BAC pBeloBAC11 : Quatre fragments d’ADN qui se chevauchent (Z1-Z4), couvrant l’ensemble du génome de ZIKV (figure 1) et flanqués des sites de restriction indiqués, ont été générés par des produits chimiques synthèse et cloné séquentiellement en pBeloBAC11 pour générer le clone infectieux ZIKV cDNA pBAC-ZIKV. L’ADNc infectieux ZIKV intégral a été assemblé sous le contrôle du promoteur humain cytomégalovirus immédiatement précoce (CMV) et flanqué à l’extrémité 3′-extrémité par le Ribozyme HDV (RZ) et l’hormone de croissance bovine (BGH) terminaison et les séquences de polyadenylation. Les acronymes des gènes viraux et des éléments régulateurs sont décrits à la figure 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Flux de travail pour générer du rZIKV à partir du clone d’ADNc BAC. Les cellules vero à 90% de la confluence ont été transfectées en monocouche avec le clone cDNA infectieux ZIKV pBAC-ZIKV (Figure 2) utilisant des liposomes cationiques. À 4-6 jours de posttransfection, quand CPE était évident, les supernatants de culture de tissu contenant le rZIKV ont été rassemblés et évalués pour la présence du virus (figure 4) et utilisés pour l’amplification virale dans les cellules de Vero. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Récupération et caractérisation in vitro de rZIKV. (A) Sauvetage du rZIKV infectieux du clone de l’ADNc BAC : les cellules Vero à 90 % de la confluence (format de plaque 6 puits, triplicats) ont été simulées ou transfectées avec 4 g/puits de pBAC-ZIKV (figure 3), et aux jours indiqués posttransfection, Les titres de virus dans les supernatants de culture de tissu ont été déterminés par l’analyse de plaque (PFU/mL). Les barres d’erreur indiquent les écarts types de trois expériences de transfection différentes. La ligne noire pointillée indique la limite de détection (50 PFU/mL). (B) Les cellules virales cPE:Vero à 90% de confluence (format de plaque de 6 puits, triplicates) ont été simulées (en haut) ou infectées (MOI de 0,5 PFU/cellule) avec rZIKV, et à 48 h postinfection, la présence de CPE a été évaluée par microscopie légère. Barres d’échelle de 100 m. (C) Analyse de la plaque virale et immunostaining : Les cellules Vero à 90 % de confluence (format de 12 puits) ont été infectées par le rZIKV, et à 72 h après l’infection, les plaques virales ont été visualisées par coloration violette cristalline (à gauche) ou par immunostaining ( à droite) à l’aide du pan-flavivirus E protéine mAb 4G2. Barres d’échelle de 5 mm(D) Immunofluorescence : Les cellules vero à 90 % de confluence (format de plaque de 24 puits, tripliciates) ont été infectées (MOI de 0,5 PFU/cellule) avec rZIKV et, à 48 h postinfection, analysées par immunofluorescence à l’aide du mAb 1176-56, spécifique pour ZIKV E protéine. Les noyaux de cellules ont été souillés avec DAPI. Une image fusionnée représentative des cellules Vero zikV-infectées est montrée. Le carré blanc en haut à droite représente une image agrandie des cellules Vero infectées par le ZIKV. Barres d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Les clones infectieux de l’ADNc constituent des outils moléculaires essentiels pour la recherche fondamentale sur les virus à ARN et le développement de vaccins et/ou l’identification de stratégies antivirales. Cependant, pour de nombreux virus à ARN à brin positif, y compris les flavivirus, la génération de clones infectieux d’ADNc est difficile en raison de l’instabilité des CDNA clonés lorsqu’ils se propagent dans des bactéries utilisant des plasmides standard à grand nombre de copies. Dans le cas de ZIKV et d’autres flavivirus, cette instabilité est principalement due à l’expression de fuites de protéines virales toxiques provenant de promoteurs bactériens cryptiques présents dans le génome viral14,15,16,17 . Ici, nous décrivons un protocole alternatif et puissant pour générer un clone d’ADNc infectieux complet zikV stable comme un plasmide simple, basé sur l’utilisation du plasmique BAC pBeloBAC1134 (figure 2A) pour surmonter le problème de toxicité, l’utilisation de la Promoteur CMV pour permettre l’expression de l’ARNr v dans le noyau des cellules transfectées, et le HDV RZ pour générer des vRNAs avec des 3′-extrémités précises (Figure 2B). En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer un clone infectieux entièrement stable de la souche ZIKV RGN qui permet la récupération efficace et fiable du rZIKV infectieux après la transfection directe des cellules Vero sensibles (figure3 et Figure 4).

Un énorme effort a été fait au cours des dernières années pour surmonter les problèmes d’instabilité associés aux clones d’ADNc infectieux ZIKV, et plusieurs approches ont été mises en œuvre avec succès18, y compris la ligature in vitro des fragments d’ADNc24 ,25, plasmides à faible copie19,20, l’inactivation des promoteurs bactériens cryptiques par l’introduction de mutations silencieuses26,27, insertion intron21, 22 Ans , 23, la méthode d’assemblage Gibson30, la méthode ISA28,29, et l’utilisation de CPER31. Bien que ces approches surmontent le problème de toxicité et soient utiles pour générer des clones d’ADNc infectieux ZIKV, certaines d’entre elles sont laborieuses et présentent plusieurs inconvénients, y compris la nécessité de la ligature in vitro et des étapes de transcription qui réduisent le virus l’efficacité de récupération ou l’introduction d’un nombre élevé de mutations silencieuses pour inactiver le promoteur bactérien cryptique qui pourrait affecter la forme physique virale, entre autres. L’approche décrite dans ce protocole présente les avantages suivants. i) Le plasmique BAC pBeloBAC1134 a une réplication strictement contrôlée, en gardant une ou deux copies de plasmide par cellule, ce qui minimise la toxicité et permet un entretien stable dans les bactéries de cDNA instables. ii) La propagation et la modification des plasmides BAC sont presque similaires à celles des plasmides conventionnels, compte tenu des légères modifications décrites dans ce protocole pour manipuler des fragments d’ADN BAC de grande taille et des plasmides à faible copie. Notamment, le clone d’ADNc BAC peut également être modifié en E. coli par recombinaison homologue à l’aide du système de recombinaison rouge42,43,44. iii) L’utilisation du promoteur CMV permet au l’expression intracellulaire de l’ARNr de ZIKV plafonné et la récupération des virus infectieux sans exiger une étape in vitro de transcription. iv) Le rZIKV infectieux est généré après la transfection directe des cellules sensibles (p. ex. Vero) avec le clone de l’ADNc BAC. Étant donné que la transfection de l’ADN dans les cellules de mammifères est plus efficace que la transfection de l’ARN, l’efficacité de récupération du virus avec l’approche BAC est plus élevée que celle observée à l’aide de transcriptions d’ARN, ce qui réduit le nombre de passages dans les cellules de culture pour générer un stock viral et, par conséquent, limitant l’introduction de mutations indésirables par l’adaptation de la culture cellulaire.

Enfin, le potentiel de l’approche BAC est soutenu par l’utilisation réussie de cette méthode (avec de légères modifications) pour concevoir des clones infectieux d’adnascisation d’autres flavivirus, y compris le virus de la dengue36, et plusieurs coronavirus à fort impact dans santé humaine et animale, comme le coronavirus transmissible de gastro-entérite37 (TGEV), le virus de péritoite infectieuse féline38 (FIPV), le coronavirus humain OC4339 (HCoV-OC43), le coronavirus aigu grave de syndrome respiratoire40 (SRAS-CoV), et le coronavirus41 du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), entre autres.

Dans le protocole décrit ici, il y a deux étapes critiques qui devraient être prises en considération. Une considération importante est d’identifier les sites de restriction uniques appropriés dans le génome viral qui sont absents dans le plasmide de BAC. Si aucun site de restriction adéquat n’est disponible, de nouveaux sites de restriction peuvent être générés au cours de la conception du clonage par l’introduction de mutations muets nucléotides. Une autre question importante est que les plasmides BAC sont présents dans seulement une ou deux copies par cellule, et donc, de faibles rendements de plasmides BAC avec une forte contamination de l’ADN génomique bactérien sont obtenus en utilisant des protocoles standard conçus pour les plasmides à nombre moyen. Ce problème potentiel est facilement surmonté en utilisant de grands volumes de culture et en purifiant le plasmide BAC avec un kit commercial spécialement développé pour la purification BAC.

En résumé, nous avons développé une puissante approche génétique inverse ZIKV basée sur l’utilisation d’un BAC qui pourrait être adapté pour générer des clones d’ADNc infectieux stables et entièrement fonctionnels d’autres virus d’ARN à brin positif pour faciliter l’étude de la biologie de ces et la mise au point de vaccins et/ou pour faciliter l’identification des médicaments antiviraux.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tient à remercier Carla Gomez pour son assistance technique dans la génération de clones de l’ADNc BAC et Snezhana Dimitrova pour son aide à la préparation de la vidéo. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Ministère espagnol de l’économie et de la compétitivité (MINECO, numéro de subvention BFU2016-79127-R) à la F.A.T. et aux National Institutes of Health (NIH, subvention numéro 1R21AI120500) à L.M.S. et F.A.T.

Materials

1. Molecular Biology Reagents
Afe I New England BioLabs R0652S 10,000 units/mL
AmpliTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) N8080161 5,000 Units/mL
ApaL I New England BioLabs R0507S 10,000 units/mL
Asc I New England BioLabs R0558S 10,000 units/mL
BamH I New England BioLabs R0136S 10,000 units/mL
BstB I New England BioLabs R0519S 20,000 units/mL
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
ElectroMAX DH10B Cells  ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 18290015 Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm Bio-Rad 165-2086
Ethanol Merck 100983 Flamable
Isopropanol Merck 109634 Flamable
Large-Construct Kit (10) QIAGEN 12462 For high-purity BAC preparation
LB Broth ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 12780029 Can be homemade as well
LB with Agar ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 22700041 Can be homemade as well
Methanol Merck 106009 Flamable
Mlu I New England BioLabs R0198S 10,000 units/mL
Oligonucleotides IDT N/A
Plasmid pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 12143 For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml I New England BioLabs R0532S 20,000 units/mL
Polypropylene tubes (10 mL) DeltaLab 175724 Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) QIAGEN 20021 Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/mL
SOC Medium ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 15544034 Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragments Bio Basic N/A
T4 DNA Ligase Sigma-Aldrich (Roche) 10481220001 1,000 units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 140675
12-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 150628
24-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 142485
Agar Noble VWR 214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody Varies N/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody Varies N/A
Cell Culture Dishes (100×21 mm) ThermoFisher Scientific (Nunc) 172931
Conical Tubes (15 mL) VWR 525-0150
Conical Tubes (50 mL) VWR 525-0155
Crystal Violet Sigma-Aldrich C6158
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Toxic and carcinogenic
DEAE-Dextran Sigma-Aldrich D9885
DMEM ThermoFisher Scientific (Gibco) 11995065
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific (HyClone)) SV30160.03
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Toxic and carcinogenic
L-Glutamine ThermoFisher Scientific (Gibco) 25030081
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 11668019 Transfection reagent
Nonessential amino acids ThermoFisher Scientific (Gibco) 11140035
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific (Gibco) 31985070 Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 BEI Resources NR-50327
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710-S Toxic and carcinogenic
PBS ThermoFisher Scientific (Gibco) 14190144
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific (Gibco) 15140122
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific (Invitrogen) P10144
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories Inc PK-4010 Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero Cells ATCC CCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56 BioFront Technologies BF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Bio-Rad 1704468 Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 Cabinet Varies N/A Other commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated Centrifuge Varies N/A
Fluorescence Microscope Varies N/A
High-Speed Refrigrated Centrifuge Varies N/A
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100 Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal Cycler ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) A24811 Other machines are acceptable
Vortexer Varies N/A
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Referencias

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Ávila-Pérez, G., Park, J., Nogales, A., Almazán, F., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone. J. Vis. Exp. (148), e59537, doi:10.3791/59537 (2019).
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