Denne protokol beskriver en in vitro batch-kultur fermenterings system af humant fækal mikrobiota, ved hjælp af inulin (en velkendt prebiotiske og en af de mest udbredte studerede mikrobiota modulatorer) at demonstrere brugen af dette system til at anslå virkningerne af specifikke interventioner på fækal mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter.
Den nye rolle, som tarm mikrobiomet spiller i flere menneskelige sygdomme, kræver et gennembrud af nye værktøjer, teknikker og teknologier. Sådanne forbedringer er nødvendige for at dechifrere udnyttelsen af mikrobiome modulatorer til gavn for menneskers sundhed. Men den omfattende screening og optimering af modulatorer til validering af mikrobiome modulation og forudsige relaterede sundhedsmæssige fordele kan være praktisk vanskeligt på grund af behovet for et stort antal dyr og/eller menneskelige. Med henblik herpå kan in vitro-eller ex vivo-modeller lette den foreløbige screening af mikrobiome modulatorer. Heri, det er optimeret og demonstreret en ex vivo fækal mikrobiota kultur system, der kan anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige interventioner af Gut mikrobiome modulatorer herunder probiotika, prebiotics og andre fødevareingredienser, bortset fra nutraceuticals og narkotika, om mangfoldigheden og sammensætningen af den humane tarm mikrobiota. Inulin, en af de mest udbredte undersøgte prebiotiske forbindelser og mikrobiome modulatorer, bruges som et eksempel her for at undersøge dens virkning på den sunde fækale mikrobiota sammensætning og dens metaboliske aktiviteter, såsom fækal pH og fækale niveauer af organiske syrer herunder laktat og kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for undersøgelser, der har til formål at anslå virkningerne af forskellige interventioner af modulatorer på fækale mikrobiota profiler og at forudsige deres sundhedsmæssige konsekvenser.
Den humane mikrobiota er et komplekst fællesskab bestående af bakterier, archaea, vira og eukaryote mikrober1, der bebor den menneskelige krop internt og eksternt. Nylige beviser har fastlagt den grundlæggende rolle, som Gut mikrobiota og tarm mikrobiome (hele samlingen af mikrober og deres gener findes i den menneskelige mave-tarmkanalen) i forskellige sygdomme hos mennesker, herunder fedme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, og kræft1,2,3. Derudover producerer de mikroorganismer, der lever i vores tarm, et bredt spektrum af metabolitter, som i væsentlig grad påvirker vores helbred og kan også bidrage til patofysiologien af flere sygdomme samt en række metaboliske funktioner4, 5. unormale ændringer (perturbationer) i sammensætningen og funktionen af denne Gut mikrobielle population er generelt betegnes som “Gut dysbiosis”. Dysbiosis er normalt forbundet med en usund tilstand af værten og dermed kan differentieres fra den normale (homeostatisk) mikrobielle samfund forbundet med en sund kontroltilstand af værten. Specifikke mønstre af Gut mikrobiome dysbiosis findes ofte i forskellige forskellige sygdomme1,2,3,6,7.
Fermentering af ufordøjet mad, især de fermenterbare kulhydrater/fibre, af Gut mikrobiota ikke kun giver energi, men også producerer divergerende metabolitter, herunder kortkædede fedtsyrer (scfas), lactat, formate, carbondioxid, metan, brint og ethanol6. Desuden producerer Gut mikrobiota også en række andre bioaktive stoffer såsom folat, biotin, trimethylamin-N-oxid, serotonin, tryptophan, gamma-aminosmørsyre, dopamin, noradrenalin, acetylcholin, histamin, deoxycholic Acid og 4-ethylphenyl sulfat. Dette sker primært gennem udnyttelse af iboende metaboliske strømme inden for værten-Microbe niche, som bidrager i flere krops processer, metaboliske funktioner og epigenetiske ændringer1,8,9, 10. Virkningerne af forskellige interventioner på sådanne mikrobielle produkter forbliver imidlertid ukendte eller uklare på grund af manglen på enkle, effektive og reproducerbare protokoller. Den menneskelige tarm mikrobiota sammensætning er et yderst komplekst og mangfoldigt økosystem, og derfor er mange spørgsmål om dets rolle i menneskers sundhed og sygdoms patologi stadig ubesvarede. Virkningerne af mange almindelige tarm mikrobiome modulatorer (fx probiotika, prebiotics, antibiotika, fækal transplantation og infektioner) på sammensætningen og metaboliske funktioner i tarm mikrobiota forbliver stort set undvigende. Desuden er undersøgelse og validering af disse virkninger in vivo vanskelig, især fordi de fleste af de næringsstoffer og metabolitter, der produceres af tarmen mikrobiota absorberes eller bortskaffes samtidigt og hurtigt i tarmen; Derfor er det stadig en praktisk udfordring at måle produktionen, mængden og forarbejdningen af disse metabolitter (f. eks. SCFAs) in vivo. Fysiologiske modeller såsom dyr og mennesker er afgørende for at bestemme rollen for Gut-mikrobiom og dets graduering på værts sundheden, men disse kan ikke være egnede til storstilet screening af forskellige typer af mikrobiome modulatorer på grund af etiske, monetære eller tidsmæssige begrænsninger. Med henblik herpå kan in vitro-og/eller ex vivo-modeller, såsom dyrkning af Gut mikrobiota in vitro og derefter intervenere med forskellige mikrobiota-modulatorer, tilbyde tids-og pengebesparende muligheder og kan derfor give mulighed for foreløbig eller storstilet screening af forskellige komponenter (såsom probiotika, prebiotics, og andre interventionelle forbindelser) til at undersøge/forudsige deres virkninger på fækal mikrobiota mangfoldighed, sammensætning og metaboliske profiler. Undersøgelser, der anvender sådanne in vitro-og ex vivo-systemer i tarm mikrobielle stoffer, kan fremme en yderligere forståelse af værts-mikrobiom-interaktioner, som bidrager til at være vært for sundhed og sygdom, og kan også føre til at finde nye terapier, der er målrettet mod mikrobiomet, til forbedre Host sundhed og forebygge og behandle forskellige sygdomme1.
Selv om in vitro Gut mikrobiota kultur systemer ikke rigtig kan replikere de faktiske tarm betingelser, har flere laboratorier bestræbt sig på at udvikle sådanne modeller, hvoraf nogle er blevet fundet praktisk gennemførligt til en vis grad og er blevet anvendt med succes til forskellige formål. En af de seneste Gut modeller er simulatoren af den menneskelige tarm mikrobielle økosystem, som efterligner hele menneskelige mave-tarmkanalen, herunder maven, tyndtarmen, og forskellige regioner i tyktarmen. Men sådanne teknisk komplekse modeller er muligvis ikke tilgængelige for andre forskningsfaciliteter på verdensplan. Der er derfor stadig et kritisk behov for udvikling af nye alternative modeller, der er relativt enkle, overkommelige og praktiske for laboratorier, som studerer mikrobiome modulatorer og deres virkninger på tarm mikrobiota og værts sundhed. Derfor ville brugen af et in vitro (eller ex vivo) fækale mikrobiota-kultur system være nyttigt til at studere virkningerne af sådanne interventioner11,12. Specifikt, virkningen af forskellige prebiotics på mikrobiota fermenterings kapacitet i form af periodiske ændringer i tarm mikrobiota mangfoldighed og sammensætning, fækal pH, og niveauerne af mikrobielle metabolitter, herunder SCFAs og lactat kan undersøgt 13. heri, ved hjælp af inulin (en af de mest udbredte undersøgt prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiome modulator, en trin-for-trin protokol af denne simple ex vivo mikrobiota batch-kultur system er beskrevet for at demonstrere dets anvendelse til at anslå ændringer i fækale mikrobiota og mikrobielle metabolitter efter intervention med mikrobiome modulatorer.
In vitro fækal gylle fermenterings model præsenteret her er en simpel single-batch model til at tilnærme virkningerne af forskellige substrater og mikrobielle stammer (f. eks prebiotics og probiotika) på sammensætningen af human fækal mikrobiota samt dens metaboliske aktiviteter i form af fækal pH og SCFAs niveauer. Resultaterne præsenteres heri viser, at inokulering af inulin nedsætter fækal pH og øger niveauet af SCFAs og lactat i inulin-behandlet fækal model i forhold til ikke-behandlede fækale mikrobiota…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender taknemmeligt støtte fra Center for diabetes, fedme og metabolisme og det kliniske og translationelle videnskabscenter, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (tilskudsnummer: W81XWH-18-1-0118), Kermit Glenn Phillips II stol i hjerte-kar-medicin; National Institutes of Health finansierede Claude D. Pepper ældre amerikanere Center (finansieret af P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og det kliniske og translationelle videnskabs Center (klinisk forskningsenhed, finansieret af UL1TR001420), er også heldigvis anerkendt. Vi takker også de frivillige for at levere fækale prøver, og vores andre Lab medlemmer for deres tekniske hjælper under dette eksperiment.
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
0.22 µm membrane filter | |||
AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
Bottle filter | Corning | ||
Cheesecloth | |||
Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
pH meter | |||
Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
Vortex | Thermoscientific | ||
Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |