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Inmunología y contagio

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/59478
, , , , ,
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine,University of Cambridge, 3University of Cardiff

Summary

Gli organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) offrono interessanti opportunità per modellare le malattie enteriche in vitro. Dimostreremo la differenziazione degli hiPSCs in organoidi intestinali (iHOs), la stimolazione di questi iHOs con citochinesi e la microiniezione di Salmonella typhimurium nel lume Iho, permettendo lo studio di un’invasione epiteliale da parte di questo agente m patogeno.

Abstract

Il sistema intestinale ‘ organoide ‘ (iHO), in cui le strutture 3-D rappresentative del rivestimento epiteliale dell’intestino umano possono essere prodotte da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSCs) e mantenute nella cultura, offre un’entusiasmante opportunità per facilitare la modellazione della risposta epiteliale alle infezioni enteriche. In vivo, le cellule epiteliali intestinali (IECs) svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell’omeostasi intestinale e possono inibire direttamente gli agenti patogeni, anche se i meccanismi con cui ciò avviene non sono completamente chiariti. La citochine interleuchina-22 (IL-22) ha dimostrato di svolgere un ruolo nel mantenimento e nella difesa della barriera epiteliale intestinale, tra cui indurre un rilascio di peptidi antimicrobici e chemochine in risposta all’infezione.

Descriviamo la differenziazione dei controlli sani hiPSCs in iHOs attraverso l’aggiunta di combinazioni di citochine specifiche al loro mezzo di coltura prima di incorporarli in un sistema di coltura prointestinale a matrice di membrana seminterrato. Una volta incorporati, gli iHOs sono coltivati in media completati con Noggin, R-spondin-1, fattore di crescita epidermica (EGF), CHIR99021, prostaglandina E2 e Y-27632 dicloridrato monoidrato. Passaggi settimanali per interruzione manuale dell’ultrastruttura iHO portano alla formazione di iHOs in erba, con alcuni che presentano una struttura di cripta/Villus. Tutti gli iHOS dimostrano un epitelio differenziato costituito da cellule di calice, cellule Enteroendocrine, cellule Paneth e enterociti polarizzati, che possono essere confermati tramite immunocolorazione per marcatori specifici di ogni sottoinsieme di cellule, microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e PCR quantitativa (qPCR). Per modellare l’infezione, Salmonella enterica Sierovar typhimurium SL1344 è microiniettata nel lume degli iHOS e incubato per 90 min a 37 ° c, e viene eseguito un saggio di protezione di gentamicina modificato per identificare i livelli di invasione batterica. Alcuni iHOs sono anche pretrattati con IL ricombinante umano IL-22 (rhIL-22) prima dell’infezione per stabilire se questa citochina è protettiva contro l’infezione da Salmonella .

Introduction

Negli ultimi anni, lo studio delle interazioni ospite-patogeno è stato potenziato dallo sviluppo di modelli ‘ organoidi ‘, in cui le rappresentazioni di 3-D dell’epitelio intestinale possono essere prodotte da vari progenitori. Gli organoidi “primari” possono essere generati direttamente dalle cellule staminali intestinali raccolte da biopsie intestinali. Inoltre, gli organoidi intestinali possono essere generati da hiPSCs. Lo stesso si può dire di numerosi tessuti, con gastrico1,fegato 2, pancreatico3,4, cervello5,6, polmone7, e prostata8 organoidi utilizzati da molti ricercatori per modellare malattia. Ci sono numerose applicazioni emozionanti del sistema organoide, tra cui la modellazione di cancro9 e screening dei farmaci10, ma qui ci concentriamo sull’uso di iHOS come un modello di infezione, utilizzando S. enterica Sierovar typhimurium (S. Typhimurium) come patogeno esemplare e pretrattamento con IL-22 come terapia.

In questo studio, gli hiPSCs utilizzati per generare iHO sono IPSC ‘ Kolf2’, generati da un individuo sano e disponibili dal Consorzio di iniziativa per le cellule staminali pluripotenti indotta dall’uomo (HipSci; www.hipsci.org), un pannello di riferimento a accesso aperto di caratterizzato linee hiPSC11. Un vantaggio dell’utilizzo degli hiPSCs come progenitori per gli organoidi è che ora sono disponibili estese banche di linee iPSC di donatori sani, il che significa che i risultati possono essere convalidati in un certo numero di linee cellulari con diversi background genetici. Inoltre, qualora i ricercatori desiderino esaminare specifici polimorfismi a singolo nucleotide associati alla malattia (SNP), è possibile utilizzare CRISPR/Cas9 per progettare mutazioni in una linea cellulare sana, producendo così sia una linea mutante che mantenendo l’isogenica linea di controllo per il confronto12. Nella nostra esperienza, gli organoidi intestinali derivati da hiPSC sono di dimensioni maggiori rispetto alle loro controparti primarie e più coerenti nella cultura, rendendo la microiniezione meno impegnativa dal punto di vista tecnico e permettendo potenzialmente una gamma più diversificata di patogeni da Studiato. gli iHOs possono essere conservati criogenicamente, e abbiamo propagato le colture iHO fino a un anno per produrre materiale per la sperimentazione.

In vivo, gli IECs giocano un ruolo chiave nella regolazione dell’omeostasi intestinale e possono inibire direttamente gli agenti patogeni, anche se i meccanismi con cui ciò avviene non sono ben compresi. La citochina IL-22 è noto per avere un ruolo nel mantenimento della barriera epiteliale intestinale13 ed è coinvolto nell’induzione e la secrezione di peptidi antimicrobici e chemochine in risposta all’infezione14. È prodotto da cellule T attivate (in particolare, cellule Th17) così come da cellule Natural Killer (NK) e si lega a un recettore eterodimerico composto da il-22r1 e il-10r2 subunità15. Il recettore per IL-22 è espresso basalmente su IECs, il che significa che nel modello iHO, è possibile pretrattare gli organoidi con rhIL-22 semplicemente con la sua aggiunta alla coltura medium16. Uno svantaggio del sistema organoide è che manca la risposta immunitaria associata normalmente consegnato da altri tipi di cellule immunitarie; Tuttavia, i modelli stanno emergendo che tentano di coculture organoidi con linfociti intestinali per rappresentare meglio questo17,18.

L’uso del sistema di microiniezione è fondamentale per simulare le infezioni nel modello iHO, poiché ciò consente la consegna diretta di agenti patogeni alla superficie apicale dell’epitelio, come si verificherebbe nel caso di infezione in vivo. L’aggiunta di rosso fenolo alla soluzione batterica iniettata nell’iHO segna quelle che sono state infettate, evitando così ripetute iniezioni dello stesso iHO. Gli organoidi come vasi per la modellazione delle infezioni stanno crescendo in uso, con agenti patogeni come Helicobacter pylori,19 il norovirus,20 il rotavirus,21 Escherichia colidi produzione di tossina Shiga22, Cryptosporidium23, e il virus Zika24 hanno dimostrato di sopravvivere e replicare all’interno di questi sistemi. Questa tecnologia potrebbe essere applicata a una più ampia gamma di agenti patogeni, in particolare agli organismi che sono difficili da cultura, come i protozoi, o gli agenti patogeni con restrizioni umane, al fine di ottenere informazioni dirette sulla risposta epiteliale umana all’infezione.

Protocol

1. coltura e Passaging di cellule staminali pluripotenti indotte Nota: Tutti i metodi descritti qui utilizzano linee cellulari umane disponibili in commercio. Tutti i lavori di coltura tissutale descritti di seguito devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare di classe II. gli IPSC sono regolarmente mantenuti nel mezzo di coltura delle cellule staminali (vedere la tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore, che consente una cultura senza fine settimana di iPSCs. gli iPSCs possono essere adattati da altri sistemi di coltura iPSC con relativa facilità. Passare le cellule una volta che le colonie coprono circa l’80% – 90% della superficie della piastra. Preparare le piastre per il passaggio 1 h prima dell’uso aggiungendo vitronectina 10 μg/mL diluito nella soluzione salina di Dulbecco tamponata con fosfato (DPBS; senza calcio [CA] o magnesio [mg]) a piastre trattate con coltura tissutale. I volumi per il rivestimento dipendono dalle dimensioni del piatto e possono essere trovati nelle istruzioni del produttore. Durante questo periodo, la coltura di cellule staminali calde a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il supporto dagli iPSCs pronti per il passaggio e lavare le cellule 2x con DPBS (senza CA o mg). Aggiungere la soluzione EDTA (vedere la tabella dei materiali) alle piastre, assicurandosi che l’intera superficie sia rivestita e incubare a RT per 5 – 8 min. Quando i fori iniziano ad apparire al centro delle colonie iPSC, aspirare e scartare la soluzione di EDTA. Aggiungere il terreno di coltura delle cellule staminali ai pozzi; sloggia le IPSC lavando delicatamente i supporti sulla superficie della piastra un paio di volte. Le IPSC sono passaggio come grumi e non come singole celle, quindi assicuratevi che la soluzione EDTA non venga lasciata per troppo tempo. Spostare gli iPSCs disdepositati in un tubo conico da 15 mL. Aspirare la vitronectina dalle piastre prerivestite e sostituirla con il mezzo di coltura delle cellule staminali. Invertire la sospensione iPSC un certo numero di volte per assicurarsi che gli iPSCs non si sono regolati nella parte inferiore del tubo conico, e aggiungere il volume appropriato di sospensione per dare un 1:10 diluizione di cellule su una nuova piastra. I rapporti di divisione possono essere regolati a seconda del tasso di crescita iPSC, che può variare tra le linee iPSC. Roccia la piastra per disperdere gli iPSCs sulla superficie e posizionarlo in un incubatore a 37 ° c/5% CO2. Alimentare gli iPSCs il giorno dopo la passaging. 2. differenziazione dagli IPSC al hindgut Il giorno 0, dividere le iPSCs su un piatto di 10 cm tessuto-coltura trattata, prerivestita con vitronectina come descritto al passo 1,2, in 10 ml di coltura di cellule staminali integrate con activina a (10 ng/ml) + fattore di crescita fibroblasti di base (bFGF; 12 ng/ml). Aggiungere i fattori di crescita ai media direttamente prima dell’uso; eseguire questa procedura in tutti i passaggi successivi. Il giorno 1, cambiare il supporto (10 ml di coltura di cellule staminali con activina a [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]). Il 2 ° giorno, iniziare la differenziazione cambiando il supporto a 10 ml di coltura di cellule staminali integrate con i seguenti fattori di crescita: activina a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4; 10 ng/ml), fosfoinositolo 3- inibitore della chinasi LY294002 (10 μM) e GSK3 inibitore CHIR99021 (3 μM). Il giorno 3, cambiare il supporto a 10 ml di coltura di cellule staminali integrate con activina a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) e LY294002 (10 μm). La specifica endoderm indotta da questo mezzo dovrebbe comportare cambiamenti visibili nella morfologia della Colonia iPSC nelle prossime 24 ore. Il giorno 4, cambiare il supporto a 10 ml di media RPMI/B27 completati con activina a (100 ng/ml) e bFGF (100 ng/ml).Nota: I supporti RPMI/B27 contengono 500 mL di liquido RPMI con supplemento di L-glutamina (vedere tabella 1), 10 ml di integratore B27 (50x, senza siero) e 5 ml di aminoacidi non essenziali. Facoltativo: aggiungere 5 mL di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL). Filtrare-sterilizzare prima dell’uso. Il giorno 5, modificare il supporto a 10 ml di media RPMI/B-27 completati con activina a (50 ng/ml). Il giorno 6, per iniziare patterning l’endoderma posteriore al retrointestino, cambiare il supporto a 10 ml di media RPMI/B27 completati con CHIR99021 (6 μm) + acido retinoico (3 μm). Nei giorni 7, 8e 9, ripetere il passaggio 2,7. Durante questi passaggi, le strutture 3-D visibili dell’intestino posteriore dovrebbero diventare evidenti, coprendo la superficie della piastra. Il giorno 10, incorporare il conseguente intestino posteriore nella matrice di membrana seminterrato (vedere la tabella dei materiali). 3. incorporamento del hindgut nella matrice della membrana del seminterrato Compongono iHO base Growth media (500 mL di medium Eagle modificato di Dulbecco avanzato [DMEM]/F12, 10 mL di supplemento di B27 [50x, senza siero], 5 ml di supplemento di N2 [100x, senza siero], 5 mL di 1 M 4-(2-idrossietil) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), e 5 mL di aminoacidi non essenziali [100x]. Facoltativo: aggiungere 5 mL di penicillina-streptomicina [10.000 U/mL]; filtro-sterilizzare prima dell’uso. Vedere tabella 1). Rimuovere il supporto dalla piastra posteriore e lavare la piastra 1x con DPBS (senza CA o mg). Aggiungere 5 mL di soluzione di collagenasi alla piastra e incubare a 37 ° c per 5 min. Produrre la soluzione di collagenasi aggiungendo 500 mg di collagenasi polvere E.V. a 400 mL di DMEM/F12 avanzato. A seguito di questo, aggiungere 100 mL di sostituzione del siero (vedere la tabella dei materiali), 5 ml di L-glutammina (200 mm), e 3,5 μl di 2-mercaptoetanolo, e turbinare la soluzione da miscelare. Filtrare-sterilizzare la soluzione una volta che la polvere di collagenasi è completamente disciolta.Nota: Questo può essere conservato a-20 ° c per un massimo di 6 mesi in aliquote più piccole. Inattivare la collagenasi aggiungendo 5 mL di supporto di crescita di base iHO alla piastra e raschiare le cellule del retrointestino utilizzando un raschietto cellulare, raccogliendo la sospensione del retrointestino in un tubo conico da 15 mL. Centrifugare a 240 x g per 1 min e pipettare il surnatante. Aggiungere 10 mL di media, rompere il retrointestino in pezzi più piccoli con un pipettaggio delicato e centrifugare nuovamente a 95 x g per 1 min. Lavare le cellule 2x nel supporto di crescita di base iHO ripetendo il passo 3,5. Risospendere le cellule in un piccolo volume di mezzo di crescita di base (~ 300 – 500 μL) e aggiungere circa 100 μL di questa soluzione a 1,5 mL di matrice di membrana del basamento. La matrice deve rimanere sul ghiaccio durante questo periodo in quanto inizierà a solidificare rapidamente a RT. Impostare una piastra 24-Well su un riscaldatore a piastre a 37 ° c e individuare 60 μL in un pozzo della piastra 24-well. Lasciare che si imposti brevemente e controllare la densità al microscopio. Se necessario, aggiungere più soluzione di Crasso alla matrice di membrana seminterrato in incrementi fino a raggiungere la concentrazione desiderata, e individuare la soluzione nei pozzi rimanenti. Incubare a 37 ° c per 10 min; quindi, aggiungere 800 μL di supporti di crescita di base iHO contenenti fattori di crescita a ciascun pozzetto della piastra 24-well alle seguenti concentrazioni (vedere tabella 1): 500 ng/ml R-spondina-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml fattore di crescita epidermica (EGF), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandina E2 e 10 μM Y-27632 dicloridrato monoidrato (inibitore di roccia). Cambiare il supporto di crescita di base iHO ogni 2 – 3 giorni, o immediatamente se il supporto inizia a scolorimento. Dopo la semina iniziale nella matrice della membrana del seminterrato, lasciare che gli iHOs si sviluppino per 7 giorni prima di dividerli. Di giorno 3 – 4, sfere distinte dovrebbero essere visibili nella cultura. Per la modifica dei supporti da solo, omettere Y-27632, poiché questa è necessaria solo quando si divide/semina. 4. manutenzione e passaggio di iHOs Per consentire lo scongelamento graduale, mettere fuori il volume richiesto di matrice di membrana seminterrato in un secchio di ghiaccio coperto a 4 ° c durante la notte, 24 h prima della scissione. Rimuovere il supporto dall’iHOs e sostituirlo con 500 μL di soluzione di sollevamento cellulare (vedere la tabella dei materiali) per pozzetto. Incubare a 4 ° c per 40 – 50 min, a quel punto il iHOs dovrebbe essere galleggiante nella soluzione. Opzionale: utilizzare un sistema di imaging in-Hood per selezionare solo gli iHOs con la morfologia desiderata (vedere la tabella dei materiali). Pipettare delicatamente la sospensione della soluzione di sollevamento iHO/Cell in provette coniche da 15 mL, cercando di non rompere gli iHOs. Lasciate che gli IHOs si accontentano di 3 – 5 min e rimuovete il supernatante e le singole cellule. Risospendere l’iHOs in 5 mL del mezzo di crescita di base iHO e pipettarli delicatamente per lavare. Centrifugare a 95 x g per 2 min. Impostare una piastra 24-Well su un riscaldatore a piastre a 37 ° c all’interno della cappa. Rimuovere il supernatante e risospendere gli iHOs in ~ 300 – 500 μL di media di crescita di base, utilizzando una pipetta P1000 per rompere gli iHOs in pezzi più piccoli. Si noti che la forza che deve essere applicata varia a seconda della linea iHO e lo stato di maturazione, in modo da iniziare delicatamente, aumentando la forza, se necessario. Posizionare ~ 100 μL di iHOs (il volume dipende dalla densità della soluzione) in 1,5 mL di matrice di membrana del basamento e pipettare brevemente per miscelare. Spot out 1 x 60 μL di matrice di membrana seminterrato in un pozzo della piastra 24-Well, lasciarlo a solidificare per ~ 30 s, e quindi controllare la densità sotto il microscopio. Se la densità è troppo bassa, aggiungere più iHOs alla matrice. Ripetere il passaggio 4,8 fino a quando non viene acquisita la densità corretta e quindi individuare il resto della matrice in una piastra 24-well. Posizionarlo in un incubatore a 37 ° c per 10 minuti e, quindi, sovrapporre 800 μL di supporto di crescita base con fattori di crescita, come descritto nel passaggio 3,7. Per preparare gli iHOs per un esperimento di test di invasione (descritto di seguito), passare gli iHOs 4 – 5 giorni prima dell’esperimento come descritto nei passaggi 4.1 – 4.10, ma posizionare 120 μL della soluzione di matrice iHO generata nel passaggio 4,7 in piatti di microiniezione con fondo di vetro da 5 mm. Piuttosto che lasciare la sospensione iHO in una goccia come con la passaging di routine, stendere la gocciolina sul fondo del piatto per creare un sottile strato di matrice. Coprite con 2,5 mL di media di crescita base più fattori di crescita.Nota: Se gli antibiotici sono stati utilizzati nel mezzo di coltura, questi devono essere rimossi e sostituiti con supporti non antibiotici integrati per esperimenti di microiniezione. 5. prestimulation di iHOs con rhIL-22 Aspirare i media dagli iHOs e sostituirlo con nuovi mezzi di crescita di base (che non devono contenere antibiotici) 18 h prima del test di invasione. Aggiungere rhIL-22 ai media di coltura ad una concentrazione finale di 100 ng/mL. 6. microiniezione di iHOs e saggi di invasione intracellulare Il giorno prima dell’esperimento, impostare S. Typhimurium SL1344 coltura in 10 mL di Luria-Bertani brodo e incubare a 37 ° c durante la notte con agitazione. Il giorno dell’esperimento, se è disponibile un microscopio con una camera di calore chiusa, accenderlo e lasciare che la temperatura raggiunga 37 ° c prima di iniziare il test. Diluire le colture batteriche notturne in DPBS (contenenti CA e mg) a una densità ottica di 2 a 600 Nm (OD600) e, quindi, mescolare 1:1 con il rosso fenolo. Caricare il piatto di microiniezione contenente iHOs sullo stadio del microscopio, rimuovere il coperchio e portare l’iHOs a fuoco, pronto per iniziare l’iniezione. Accendere l’iniettore e le stazioni di controllo del braccio. Assicurarsi che l’iniettore sia impostato su una pressione di 600 kPa e un tempo di iniezione di 0,5 s. Se non è già stato allontanata dalla fase del microscopio, ruotare il braccio di iniezione per assicurarsi che sia. Impostare una punta di trapano a microiniezione da 6 μm rimuovendo l’involucro e il cilindro di plastica dall’ago. Rimuovere la testa di presa dal braccio di iniezione. Caricare la punta del trapano con 10 μL di inoculo, afferrando delicatamente la punta del trapano alla sua estremità smussata. Posizionare la punta del trapano nella testa di presa e ricollegarla al braccio di microiniezione. Spostare delicatamente il braccio in posizione in modo che l’ago si trova 1 – 2 cm sopra il piatto di microiniezione. Utilizzare il controllo del braccio per posizionare la punta dell’ago al centro del piatto e abbassarla fino a quando non si trova appena sopra la superficie del supporto. Programmare la stazione di controllo del braccio per riportare l’ago a questo punto dopo tutte le iniezioni. Focalizzare il microscopio sugli iHOs e selezionare il bersaglio da iniettare. Posizionare l’ago appena sopra e a destra dell’iHO da iniettare e spostare l’ago verso il basso e lateralmente nel lume iHO. Premere il pulsante di iniezione sul microiniettore; il composto batterico fenolo-macchiato emergerà dall’ago. Iniettare ogni iHO 3x. Iniettare almeno 30 iHOs per condizione.Nota: A causa dell’eterogeneità nelle dimensioni e nella struttura di iHO all’interno di una cultura, è necessario iniettare un gran numero di iHOs per controllare la variazione. Quando tutti gli iHOs necessari vengono iniettati, rimuovere la piastra di microiniezione dallo stage, sostituire il coperchio e incubare la piastra a 37 ° c per 90 min. Dopo 90 minuti, aspirare i mezzi di crescita e sostituirlo con 3 mL di soluzione di sollevamento cellulare; Incubare a 4 ° c per 45 min. Spostare delicatamente la soluzione di sollevamento iHOs/Cell in un tubo conico da 15 mL contenente 5 mL di DPBS. Assicurarsi che tutti gli iHOs iniettati siano stati rimossi dalla piastra (sciacquare la piastra con 1 mL di DPBS, se necessario). Centrifugare a 370 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante e risospendere gli iHOs in media di crescita di base contenenti gentamicina a 0,1 mg/mL (aggiungere 1 mL di media; quindi, utilizzare una pipetta P1000 ~ 50x per rompere il iHOs, e aggiungere 4 mL di ulteriori supporti). Incubare a 37 ° c per 1 ora per uccidere i batteri extracellulari. Centrifugare gli iHOs a 370 x g per 3 min e aspirare il surnatante, lasciando il meno possibile. Lavare l’iHOs 1x con DPBS e centrifugare di nuovo.Nota: Questo passaggio rimuove la gentamicina, che è importante in quanto qualsiasi residuo di gentamicina può uccidere i batteri intracellulari una volta che le cellule vengono lisate. Risospendere l’iHOs in 500 μL di tampone di lisi (vedere la tabella dei materiali) e dissociare manualmente gli organoidi pipettando ~ 50x. Lasciare questa miscela per 5 minuti a RT. Diluire serialmente la soluzione risultante 10 volte in DPBS per generare 10-1, 10-2, e 10-3 concentrazioni. Pipettare le goccioline da 3 x 20 μL delle soluzioni pulite e diluite sulle piastre di agar LB preriscaldati. Incubare durante la notte a 37 ° c ed eseguire il conteggio delle colonie e il calcolo delle unità formanti colonie (CFU). La conta delle colonie rifletterà il numero di batteri intracellulari che sono stati rilasciati durante il processo di lisciatura delle cellule. 7. congelamento e recupero delle cellule Nota: Come notato in precedenza, è possibile conservare criogenicamente gli iHOs e ricostituirli quando lo si desidera. I processi di congelamento e scongelamento sono descritti di seguito. Selezionare i pozzetti di iHOs che si desidera congelare. Aggiungere la soluzione di sollevamento delle cellule ai pozzetti e incubare per 40 – 50 min a 4 ° c. L’iHOs dovrebbe essere galleggiante nella soluzione. Pipettare delicatamente gli iHOs in un tubo conico da 15 mL e consentire loro di stabilirsi. Rimuovere i supporti e lavare l’iHOs 1x con supporti di crescita di base (nessun fattore di crescita). Centrifugare a 95 x g per 2 min, rimuovere il surnatante e sostituirlo con un adeguato volume di fluido di congelamento delle cellule (vedere la tabella dei materiali; utilizzare il supporto secondo le istruzioni del produttore), decantare l’iHOS in flaconcini criogenici. Conservare i flaconcini in un congelatore-80 ° c durante la notte per consentire un congelamento più graduale; quindi trasferirli all’accumulo di azoto liquido. Per ricostituire gli iHOs, sbrinare rapidamente un flaconcino criogenico a 37 ° c utilizzando un bagno di acqua/tallone; quindi, pipettare delicatamente il suo contenuto in 10 mL di media di crescita di base (nessun fattore di crescita). Lasciare che gli iHOs si depositano e sostituiscano i media con ~ 300 μL di media di crescita della base fresca. NON dissociare manualmente gli iHOs. Aggiungere iHOs alla matrice di membrana seminterrato e piastra fuori come descritto nel paragrafo 3.

Representative Results

Dopo l’inizio del processo di differenziazione, le cellule dovrebbero passare attraverso lo stadio della formazione endoderma definitivo seguita dal patterning del crasso prima di incorporare nella matrice della membrana del seminterrato. Gli sferoidi si formeranno e le culture con grandi quantità di materiale contaminante saranno chiare in un periodo di diverse settimane come gli iHOs maturano. Le immagini di esempio del processo di differenziazione, incorporamento e passaging sono mostrate nella Figura 1. La configurazione del sistema di microiniezione è illustrata nella Figura 2. Gli iHOs sono microiniettati con la soluzione di fenolo rosso/batterico e mantengono il loro colore rosso, permettendo l’identificazione di iHOs infetti per prevenire iniezioni duplicate. I conteggi dei batteri intracellulari placcati vengono eseguiti a seguito del saggio di protezione della gentamicina modificata; prestimulation con rhIL-22 limita la S. Infezione da typhimurium, con meno batteri intracellulari osservati dopo il trattamento con rhIL-22 (Figura 3). Inoltre, trattiamo regolarmente gli iHOs infetti per l’immunostaining, o TEM, al fine di agevolare la visualizzazione delle interazioni batteriche IEC dell’ospite (Figura 4). Figura 1: differenziazione diretta degli IPSC in iHOs. Sequenza rappresentativa di differenziazione da IPSC a iHOs, dimostrando i cambiamenti morfologici osservati e i fattori di crescita necessari per guidare questi cambiamenti. L’endoderma definitivo si forma al giorno 4 della differenziazione, a seguito dell’esposizione a concentrazioni specifiche di combinazioni di activina A, FGF, BMP-4, LY294002 e CHIR99021. Dopo 8 giorni, il patterning di questo endoderma definitivo con concentrazioni specifiche di CHIR99021 e acido retinoico provoca la formazione di Crasso. Dopo l’incorporamento, si osserva la formazione di sferoidi. Dopo la passaging sostenuta utilizzando una matrice di membrana basamento di supporto sovrapposta a mezzo integrato con fattori di proliferazione prointestinale R-spondina 1, Noggin, EGF, CHIR99021, e prostaglandina E2, gli sferoidi progrediscono negli iHOs in erba. (Le immagini sono state scattate con ingrandimento 4x-10x). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 2: microiniezione di un iHO con S. Typhimurium. (A) il sistema di Microiniezione (vedere la tabella dei materiali) racchiuso nella camera ambientale; Questo permette l’iniezione degli iHOs in un ambiente controllato (37 ° c/5% CO2). B) l’inoculo batterico viene consegnato direttamente nel lume Iho utilizzando un microcapillare attaccato al sistema di microiniezione. C) mescolando gli inoculi batterici con il rosso fenolo, è chiaro quali iHOS sono stati infettati, evitando così duplicati iniezioni dello stesso Iho. Le immagini sono state scattate con ingrandimento 10x. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 3: Il pretrattamento degli iHOs derivato dalla linea cellulare Kolf2 con rhIL-22 limita la S. Typhimurium SL1344 invasione in cellule epiteliali intestinali. Per i saggi di protezione di gentamicina, gli iHOs sono stati trattati con 100 ng/mL di rhIL-22 18 h prima dell’infezione, o lasciati non trattati, e incubati per 90 min post-infezione. I dati sono mezzi di tre repliche tecniche per tre replicati biologici ± SEM. Per i test di significatività, sono stati utilizzati test Mann-Whitney U; p < 0,0001. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 4: interazione di IECs con S. typhimurium SL1344. Questi pannelli dimostrano che gli iHOs sono iniettati con S. Typhimurium SL1344 e incubato per 3 h, prima della fissazione e del trattamento per (A) immunofluorescenza o (B) microscopia elettronica a trasmissione. Nel pannello a, i batteri si vedono all’interno del lume Iho e interagiscono con l’epitelio. I nuclei sono macchiati con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilattato (blu), membrane cellulari con Phalloidin (rosso), e batteri con CSA-1 (verde). Le immagini vengono scattate con un ingrandimento di 20 volte. Il pannello B illustra tre diverse vie di trattamento intracellulare della Salmonella dopo l’invasione; i batteri si vedono (a) all’interno di un vacuolo contenente Salmonella, (b) libero all’interno del citoplasma e (c) in fase di autofagia. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. RPMI/B27 medium componente: quantità: RPMI 1640 media con integratore di glutammina 500 mL di B27 supplemento senza siero 50x 10 mL di supporto di crescita base iHO componente: quantità: DMEM/F12 avanzato 500 mL di B27 supplemento senza siero 50x 10 mL di Supplemento senza siero N2 100x 5 mL di HEPES 1 M 5 mL di L-Glutammina 200 mM 5 mL di Fattori di crescita per il supporto di crescita base iHO componente: quantità: Umano ricombinante R-spondin1 500 ng/mL Noggin umano ricombinante 100 ng/mL Fattore di crescita epidermico (FEG) 100 ng/mL Prostaglandina E2 2,5 μM CHIR99021 3 μM di Y-27632 dicloridrato monoidrato 10 μM di Tabella 1: ricette dei media.

Discussion

Questo protocollo delinea la differenziazione degli hiPSCs in iHOs e la loro utilità come modello in cui simulare le infezioni enteriche. Di seguito, delineamo le fasi critiche del protocollo e le modifiche o i miglioramenti che abbiamo apportato.

Questo protocollo semplifica il processo di differenziazione di hiPSCs rispetto al lavoro pubblicato in precedenza25. I metodi utilizzati in precedenza richiusavano il trasferimento di hiPSCs da altri sistemi di coltura hiPSC (ad esempio, coltura hiPSC dipendente dall’alimentatore) a un mezzo definito chimicamente – alcol polivinilico (CDM-PVA). Questo trasferimento a CDM-PVA in genere richiede 2 – 3 settimane e richiede l’alimentazione quotidiana degli hiPSCs. Anche questo protocollo non è stato costantemente efficace, con alcune differenziazioni fallendo; Pertanto, abbiamo sperimentato differenziazione utilizzando gli stessi fattori di crescita, ma a partire da hiPSCs cresciuto in coltura di cellule staminali media (piuttosto che CDM-PVA) e la sostituzione di CDM-PVA con terreno coltura cellule staminali durante i giorni di differenziazione 0 – 3. Questo ha avuto successo per le cinque linee indipendenti hiPSC finora sperimentato, rendendo il processo di differenziazione molto più rapido ed efficiente. Questo permette anche la coltura senza fine settimana di hiPSCs prima della differenziazione, permettendo una maggiore flessibilità nella cultura hiPSC. le linee iHO prodotte da questo metodo sono state fenotyped per i marcatori di epitelio intestinale come abbiamo precedentemente descritto per le linee hiPSC Kolf2, Yemz1, e Lise116 e appaiono fenotipicamente indistinguibili dagli iHOS prodotti utilizzando il precedente protocollo.

Dopo la semina, iHOs richiedono almeno 1 mese di routine di passaging, con scissione ogni 4 – 7 giorni per facilitare la maturazione. Si noti che ci sarà una certa variazione nello sviluppo iHO a seconda della linea iPSC utilizzata e la densità della cultura iniziale. Durante i primi passaggi, ci saranno visibilmente contaminanti cellule che non sono iHOs. Questi saranno alla fine muoiono, lasciando una cultura pulita di sferica e, dopo circa 4 settimane, iHOs in erba. Inoltre, un sistema di imaging in-Hood può essere utilizzato per selezionare e passare solo gli iHOs con la morfologia desiderata. Poiché gli iHOs maturano, richiederanno la suddivisione ogni 6 – 7 giorni, a seconda del tasso di crescita e della densità. Se si verifica uno dei seguenti, gli iHOs devono essere divisi prima di questo punto: le cavità luminali degli iHOs iniziano a riempirsi di cellule morte, la matrice della membrana del seminterrato inizia a disintegrarsi, gli iHOs iniziano a crescere fuori dalla matrice della membrana del seminterrato, o la cultura è troppo denso e i media comincia ad andare giallo molto rapidamente.

Una volta stabilita la cultura iHO, se in qualsiasi momento l’aspetto dell’iHOs cambia o è diverso dal previsto (ad esempio, le colture rimangono sferiche, piuttosto che in erba), la fenotipizzazione tramite immunoistochimica e qPCR per i marcatori cellulari dovrebbe essere ripetuti per garantire che la differenziazione dei tipi di cellule all’interno degli iHOs (ad esempio, le cellule del calice, le cellule di Paneth) rimanga intatta. Se gli iHOs non sono più differenziati, allora devono essere scartati e ridistinti o un passaggio precedente degli iHOs deve essere scongelato e ricostituito. Se gli iHOs cessano di differenziarsi, le cause potenziali sono l’età della coltura (se ha più di 6 mesi), l’attività dei fattori di crescita (assicurarsi che queste siano ricostituite secondo le istruzioni del fabbricante e mantenute congelate in piccole aliquote per evitare cicli di congelamento-scongelamento multiplo), passaggi troppo frequenti o violenti (in generale, la passaging dovrebbe avvenire solo una volta alla settimana, e se gli iHOs sono dissociati manualmente troppo vigorosamente su base regolare, cesseranno di differenziarsi completamente).

Abbiamo stabilito tramite sequenziamento dell’RNA che il-22 stimolazione 18 h prima dell’infezione sopraregola geni antimicrobici e quelli coinvolti nel fenotipo di difesa barriera. Prima dell’uso del nuovo iHsO per i saggi che comportano la prestimolazione con rhIL-22 (o una citochina alternativa se il sistema viene utilizzato per questo), si consiglia di controllare l’attività dei geni noti per essere upregolati dalla citokina (nel caso di IL-22 , abbiamo usato DUOX2 e LCN2) via QPCR dopo la stimolazione degli iHOS, per garantire l’espressione del recettore e la segnalazione intatta. Prima del primo utilizzo di IL-22, abbiamo anche effettuato l’immunoistochimica per localizzare il recettore IL-22 su iHOs per stabilire che l’espressione del recettore IL-22 era basale, il che significa che la prestimulation poteva essere ottenuta semplicemente aggiungendo rhIL-22 alla cultura iHO medio. Tuttavia, se un recettore è apicamente espresso, questo protocollo può essere adattato per consegnare i ligandi apicamente.

Le insidie riguardanti il sistema di microiniezione sono generalmente correlate alla delicatezza degli aghi necessari per l’iniezione. Qui, usiamo punte di trapano disponibili in commercio con un lumen di 6 μm. È possibile tirare gli aghi di iniezione dai capillari di vetro26 anche se questo può essere meno uniforme, portando a perdite dalla punta dell’ago o volumi incoerenti che vengono iniettati nel iHOS. È importante essere sicuri che l’iniezione abbia avuto luogo nel lume iHO, che è un motivo per l’uso di rosso fenolo come colorante; L’iHOs si espanderà visibilmente e terrà l’inoculo rosso, permettendo certezza su quali iHOs sono stati iniettati. Occasionalmente gli aghi si intaseranno con detriti dalla parete iHO; Se questo è il caso, rimuovere la punta dell’ago dall’interno dell’iHO e premere il pulsante Clean sul sistema di microiniezione. Questo produrrà un breve periodo di pressione dell’aria superiore che dovrebbe cancellare il blocco. Inoltre, provocherà una certa fuoriuscita dell’inoculo batterico sulla piastra; Pertanto, se ciò si verifica, l’azione pulita deve essere ripetuta su tutte le piastre per garantire la parità di inoculo batterico per piastra. Un grande vantaggio degli iHOs derivati dall’hiPSC è la loro dimensione. Gli organoidi intestinali da topi e organoidi umani primari sono molto più piccoli (misurando fino a ~ 100 μm e 100 – 300 μm, rispettivamente27, versus 250 – 1500 μm per gli iHOS derivati da hiPSC), il che significa che le iniezioni di grandi quantità di organoidi saranno più lente. Questo consente esperimenti di iniezione su larga scala da sperimentato negli iHOS derivati da hiPSC. È anche possibile studiare il contenuto luminale degli iHOs raccogliendoli postinfezione e dissociando manualmente gli iHOs in DPBS, rilasciando il loro contenuto luminale. Per la microiniezione, si consiglia di utilizzare un’alta concentrazione di batteri. Abbiamo riscontrato che concentrazioni inferiori non erano sufficienti per generare una risposta dagli IECs che comprendevano gli iHOs. Inoltre, è stato difficile individuare successivamente i batteri internalizzati utilizzando la microscopia. Gli inoculums possono essere ottimizzati per diversi ceppi batterici.

In sintesi, gli iHOs derivati da hiPSC forniscono un modello promettente per dissezione diretta della risposta epiteliale alle infezioni enteriche, sia studiando il conteggio delle invasioni intracellulari, imaging, misurando i livelli di citochine nei supernatanti iHO, o RNA di raccolta per studio dei cambiamenti trascrizionali dopo l’esposizione agli agenti patogeni. La loro utilità sarà ancora più evidente in futuro per la creazione di modelli di infezione per gli agenti patogeni con restrizioni umane e per sfruttare le possibilità di utilizzare questa tecnologia per personalizzare la ricerca studiando mutazioni genetiche correlate alla malattia specifiche e le risposte farmacologiche.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti della Wellcome Trust, The Gates Foundation e del Cambridge Biomedical Research Centre. E.A.L. è uno studente di dottorato clinico supportato dal Wellcome Trust.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes MatTek corporation P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Alexa fluor 647 phalloidin Life Technologies A22287 Use at 1:1000 concentration
B27 serum-free supplement Life Technologies 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein R&D PHC9534 Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution) BD 354253
CHIR99021 Abcam  ab120890-5mg Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder Life Technologies 17104019 Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials Corning 430487
Costar TC treated 24 well culture plates Corning CLS3527
DAPI dilactate Sigma-Aldrich D9564-10MG Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) Life Technologies 14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662-100ML
Epidermal growth factor R&D 236-EG-200 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) Eppendorf 920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system) Eppendorf 5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) Life Technologies A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272-10ML Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1 Insight Biotechnology 02-91-99 Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M Life Technologies 15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) Gibco 10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement ThermoFisher
L-glutamine Life Technologies A2916801 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002 Promega UK V1201 Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x) Gibco 11140035
N2 serum-free supplement Life Technologies 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140163 Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter Eppendorf 5195000087
Prostaglandin E2 Sigma P0409-1MG Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic R&D 233-FB-025 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22 R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL 
Recombinant human R-spondin1 R&D 4645-RS-025 Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A R&D 338-AC-050 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) Gibco 12648010
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625-50MG Stock concentration 3μM, final concentration 3mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) Life Technologies 61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer) Sigma-Aldrich RES9690T-A101X Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution) Life Technologies 15040066
Vitronectin XF Stemcell Technologies  7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Y0503-1MG Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM
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Referencias

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Lees, E. A., Forbester, J. L., Forrest, S., Kane, L., Goulding, D., Dougan, G. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens. J. Vis. Exp. (147), e59478, doi:10.3791/59478 (2019).
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