Ved hjælp af human induceret pluripotente stamceller-afledte tarm Organoider til at studere og ændre epitelial cellebeskyttelse mod salmonella og andre patogener

1. kulturering og passage af inducerede pluripotente stamceller Bemærk: Alle metoder, der er beskrevet her, bruger kommercielt tilgængelige humane cellelinjer. Alt arbejde med vævskulturer, der er beskrevet nedenfor, skal udføres i en klasse II-laminar flow hætte. iPSCs vedligeholdes rutinemæssigt i stamcelle dyrkningsmediet (Se tabellen over materialer) i henhold til producentens anvisninger, som giver mulighed for en weekend-fri kultur af ipscs. iPSCs kan tilpasses fra andre iPSC-kultur systemer med relativ lethed. Passage cellerne, når kolonierne dækker ca. 80% – 90% af pladens overflade. Der fremstilles plader til passage 1 timer før brug ved tilsætning af vitronectin 10 μg/mL fortyndet i Dulbeccos fosfatbuffer (DPBS; uden calcium [ca] eller magnesium [mg]) til plader med vævskultur. Mængden af belægning afhænger af plade størrelsen og kan findes i producentens vejledning. I løbet af denne tid, varme stamcelle kulturmedium til stuetemperatur (RT). Fjern mediet fra iPSCs klar til passage og vask cellerne 2x med DPBS (uden ca eller mg). Tilføj EDTA-løsning (Se tabellen over materialer) til pladerne, og sørg for, at hele overfladen er belagt og INKUBE ved rt i 5 – 8 min. Når huller begynder at dukke op i midten af iPSC kolonier, Aspirér og kassere EDTA løsning. Tilsæt stamcelle kulturmedium til brøndene; frakoblet iPSCs ved forsigtigt at vaske medier over plade overfladen et par gange. Den iPSCs er passage som klumper og ikke som enkeltceller, så sørg for, at EDTA løsning er ikke efterladt i for lang tid. Flyt eventuelle uindleverede iPSCs til et 15 mL konisk rør. Vitronectin aspireret fra de præbelagte plader og Udskift det med stamcelle kulturmedium. Vend iPSC-suspensionen et antal gange for at sikre, at iPSCs ikke har slået sig ned i bunden af det koniske rør, og tilsæt den passende mængde suspension for at give en 1:10-fortynding af celler på en ny plade. Split nøgletal kan justeres afhængigt af iPSC-vækstraten, som kan variere mellem iPSC-linjer. Sæt pladen på for at sprede iPSCs over overfladen og anbring den i en inkubator ved 37 °C/5% CO2. Tilfør iPSCs dagen efter passage. 2. differentiering fra iPSCs til Hindgut På dag 0, split ipscs på en 10 cm vævs-kultur-behandlet fad, forbelagt med vitronectin som beskrevet i trin 1,2, i 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med Activity a (10 ng/ml) + grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF; 12 ng/ml). Tilsæt vækstfaktorerne til mediet direkte før brug; gøre dette i alle efterfølgende trin. På dag 1skiftes mediet (10 ml stamcelle kulturmedium med aktiviteter A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]). På dag 2, begynde differentieringen ved at ændre mediet til 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med følgende vækstfaktorer: Activity a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), knogle morfogenetisk protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), phosphoinositol 3- kinasehæmmer LY294002 (10 μM) og GSK3-hæmmer CHIR99021 (3 μM). På dag 3skiftes mediet til 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med Activity a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) og LY294002 (10 μM). Endoderm specifikation induceret af dette medie bør resultere i synlige ændringer i iPSC koloni morfologi i løbet af de næste 24 h. På dag 4skiftes mediet til 10 ml Rpmi/B27 Media suppleret med Activity a (100 ng/ml) og bFGF (100 ng/ml).Bemærk: RPMI/B27 medier indeholder 500 mL RPMI medium med L-Glutamin supplement (Se tabel 1), 10 ml af B27 supplement (50x, serum fri), og 5 ml ikke-essentielle aminosyrer. Valgfrit: Tilsæt 5 mL penicillin-streptomycin (10.000 e/mL). Filtrer-Steriliser før brug. På dag 5skal mediet ændres til 10 ml Rpmi/B-27 medier suppleret med aktivitet a (50 ng/ml). På dag 6skal du ændre mediet til 10 ml rpmi/B27-medier suppleret med CHIR99021 (6 μm) + retinoinsyre (3 μm) for at begynde mønstret af den bageste endoderm til bagtarmen. Gentag trin 2,7 på dag 7, 8og 9. Under disse trin bør synlige 3-D strukturer i bagtarmen blive synlige, der dækker overfladen af pladen. På dag 10, indlejre den resulterende hindgut i kælder membran matrix (Se tabellen over materialer). 3. integrering af Hindgut i Basement membran matrix Udgør iHO base vækstmedier (500 mL avanceret Dulbecco’s modificerede ørne medium [DMEM]/F12, 10 mL B27 supplement [50x, serum fri], 5 mL N2 supplement [100x, serum fri], 5 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) og 5 mL ikke-essentielle aminosyrer [100x]. Valgfrit: Tilsæt 5 mL penicillin-streptomycin [10.000 U/mL]; filter-Steriliser før brug. Se tabel 1). Fjern mediet fra bagtarm pladen, og vask pladen 1x med DPBS (uden ca eller mg). Der tilsættes 5 mL kollagenaseopløsning til pladen, og der inkueres ved 37 °C i 5 min. Fremstilling af kollagenaseopløsning ved tilsætning af 500 mg kollagenase IV pulver til 400 ml fremskreden DMEM/F12. Efter dette tilsættes 100 mL serum erstatning (Se tabellen over materialer), 5 ml L-glutamin (200 mm) og 3,5 μl 2-mercaptoethanol, og opløsningen hvirvles op for at blande. Filter-Steriliser opløsningen, når kollagenasepulveret er helt opløst.Bemærk: Dette kan opbevares ved-20 °C i op til 6 måneder i mindre aliquoter. Inaktivere kollagenase ved at tilsætte 5 mL iHO base vækstmedier til pladen og skrabe ud af bagtarm cellerne ved hjælp af en celle skraber, opsamling af hindgut suspensionen i et 15 mL konisk rør. Der centrifugeres ved 240 x g i 1 min. og pipette fra supernatanten. Tilsæt 10 mL medier, Opdel bagtarmen i mindre stykker ved forsigtigt at pipette, og centrifuge igen ved 95 x g i 1 min. Vask cellerne 2x i iHO base vækstmedier ved at gentage trin 3,5. Cellerne resuspenderes i en lille mængde basis vækstmedium (~ 300 – 500 μL), og der tilsættes ca. 100 μL af denne opløsning til 1,5 mL kælder membran matrix. Matrixen skal forblive på is i denne periode, da den vil begynde at størkne hurtigt ved RT. Sæt en 24-brønd plade på en plade varmer ved 37 °C og spot ud 60 μL i en brønd af 24-brønd pladen. Lad det sætte kort og kontrollere tætheden under et mikroskop. Hvis det er nødvendigt, tilsættes mere hindgut opløsning til kælderen membran matrix i intervaller, indtil den ønskede koncentration er opnået, og spot ud opløsningen i de resterende brønde. Der inkubeeres ved 37 °C i 10 min. Tilsæt derefter 800 μL af iHO base vækstmedier indeholdende vækstfaktorer til hver brønd af 24-brønd pladen ved følgende koncentrationer (Se tabel 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandin E2 og 10 μM Y-27632 dihydrochloridmonohydrat (ROCK-hæmmer). Skift iHO base vækstmedier hver 2 – 3 dage, eller straks, hvis mediet begynder at misfarve. Efter den indledende såning i kælderen membran matrix, tillade iHOs at udvikle sig i 7 dage før opdeling dem. Ved dag 3 – 4 skal forskellige kugler være synlige i kulturen. For medieskift alene skal du udelade Y-27632, da dette kun er nødvendigt ved opdeling/såning. 4. vedligeholdelse og passage af iHOs For at tillade gradvis optøning, skal du sætte den nødvendige mængde af kælder membran matrix i en overdækket isspand ved 4 °C natten, 24 timer før opdeling. Fjern mediet fra iHOs, og Udskift det med 500 μL celle opløftnings opløsning (se tabellen over materialer) pr. brønd. Der inkube ved 4 °C i 40 – 50 min., hvorefter iHOs skal flyde i opløsningen. Valgfrit: Brug et billedsystem i hætten til kun at vælge iHOs med den ønskede morfologi (Se tabellen over materialer). Pipettér forsigtigt iHO/Cell løfte opløsningen suspension i 15 mL koniske rør, forsøger ikke at bryde op iHOs. Lad IHOs at nøjes med 3 – 5 min og fjerne supernatanten og enkeltceller. Gensuspension af iHOs i 5 mL af iHO base vækstmedium og pipetter dem forsigtigt for at vaske. Der centrifugeres ved 95 x g i 2 min. Sæt en 24-brønd plade på en plade varmer ved 37 °C i hætten. Fjern supernatanten, og resuspér iHOs i ~ 300 – 500 μL basis vækstmedier, brug af en P1000-pipette til at opdele iHOs i mindre bidder. Bemærk, at den kraft, der skal anvendes, vil variere afhængig af iHO linje og modning tilstand, så start forsigtigt, øge kraften, hvis det kræves. Sted ~ 100 μL af iHOs (volumenet afhænger af opløsningens densitet) i 1,5 mL kælder membran matrix og pipette kortvarigt for at blande. Spot ud 1 x 60 μL af kælder membran matrix i en brønd af 24-brønd pladen, overlade det til størkne for ~ 30 s, og derefter kontrollere tætheden under mikroskopet. Hvis tætheden er for lav, tilsættes flere iHOs til matrixen. Gentag trin 4,8 indtil den korrekte tæthed er erhvervet, og derefter spot ud resten af matrixen i en 24-brønd plade. Den anbringes i en inkubator ved 37 °C i 10 minutter og overlejres derefter med 800 μL basis vækstmedium med vækstfaktorer som beskrevet i trin 3,7. For at forberede iHOs til en invasion analyse eksperiment (skitseret nedenfor), passage iHOs 4 – 5 dage før eksperimentet som beskrevet i trin 4.1 – 4.10, men sted 120 μL af matrix iHO opløsning genereret i trin 4,7 i 5 mm glas-bottomed mikroinjektionsketter. Snarere end at forlade IHO suspension i en dråbe som med rutinemæssig passage, sprede dråbe over bunden af skålen til at skabe et tyndt lag af matrix. Dæk den med 2,5 mL basis vækstmedium plus vækstfaktorer.Bemærk: Hvis antibiotika har været anvendt i kulturmedium, disse skal fjernes og erstattes med nonantibiotikum suppleret medier til mikroinjektion eksperimenter. 5. prestimulation af iHOs med rhIL-22 Aspirer mediet fra iHOs og Udskift det med friske base vækstmedier (som ikke må indeholde antibiotika) 18 timer før invasions analysen. Tilsæt rhIL-22 til dyrkningsmediet til en endelig koncentration på 100 ng/mL. 6. mikroindsprøjtning af iHOs og intracellulære invasion assays På dagen forud for eksperimentet, oprette S. Typhimurium SL1344 kultur i 10 mL Luria-Bertani bouillon og inkuberet ved 37 °C natten over med rystelser. Hvis der på forsøgs dagen er et mikroskop med et lukket varme kammer til rådighed, skal det tændes, og temperaturen kan nå op på 37 °C, inden analysen påbegyndes. Fortyndet natten bakteriekulturer i DPBS (indeholdende ca og mg) til en optisk tæthed på 2 ved 600 nm (OD600) og derefter blande det 1:1 med phenol rød. Læg mikroinjektionskålen, der indeholder iHOs, på mikroskopet, Fjern låget, og Bring iHOs i fokus, klar til at injektionen begynder. Drej injektoren og armkontrolstationerne på. Sørg for, at injektoren er indstillet til et tryk på 600 kPa og en injektionstid på 0,5 s. Hvis den ikke allerede er bakket væk fra mikroskopet, skal du dreje injektions armen for at sikre, at den er. Indstil en 6 μm mikroinjektionsspids ved at fjerne indpakningen og plastik cylinderen fra nålen. Fjern gribe hovedet fra injektions armen. Bore spidsen skal indlæses med 10 μL inokulum, og bore spidsen skal forsigtigt gribes i den stumpe ende. Anbring bore spidsen i grebs hovedet, og sæt den i mikroinjektionsarmen igen. Bevæg forsigtigt armen på plads, så nålen er placeret 1 – 2 cm over mikroinjektionskålen. Brug arm-knappen til at placere nålens spids i midten af skålen og sænk den, indtil den er lige over overfladen af mediet. Program armen kontrolstation til at returnere nålen til dette punkt efter alle injektioner. Fokuser mikroskopet på iHOs, og vælg det mål, der skal indsprøjtes. Anbring nålen lige over og til højre for den iHO, der skal injiceres, og bevæg nålen nedad og sidelæns ind i iHO lumen. Tryk på knappen Injicer på mikroinjektoren. den phenol-farvede bakterie blanding vil dukke op fra nålen. Injicer hver iHO 3x. Injicer mindst 30 iHOs pr. betingelse.Bemærk: På grund af heterogenitet i iHO størrelse og struktur i en kultur, er det nødvendigt at injicere et stort antal af iHOs at kontrollere for variation. Når alle påkrævede iHOs indsprøjtes, fjernes mikroinjektionpladen fra scenen, låget udskiftes, og pladen inkueres ved 37 °C i 90 min. Efter 90 min, Aspirer vækstmediet og Udskift det med 3 mL celle løftning løsning; inkube ved 4 °C i 45 min. Bevæg forsigtigt iHOs/Cell-løfte opløsningen til et 15 mL konisk rør, der indeholder 5 mL DPBS. Sørg for, at alle injicerede iHOs er blevet fjernet fra pladen (skyl pladen med 1 mL af DPBS, hvis det er nødvendigt). Der centrifugeres ved 370 x g i 3 min. Supernatanten fjernes, og iHOs i base vækstmediet, der indeholder gentamicin, udtages på 0,1 mg/mL (der tilsættes 1 mL af mediet, og derefter bruges en P1000-pipette ~ 50x til at opdele iHOs, og der tilsættes 4 mL yderligere medier). Inkubes ved 37 °C i 1 time for at dræbe ekstracellulære bakterier. Centrifuger iHOs ved 370 x g i 3 min., og udsug supernatanten, så lidt som muligt. Vask iHOs 1x med DPBS, og centrifuge igen.Bemærk: Dette trin fjerner gentamicin, hvilket er vigtigt, da eventuelle resterende gentamicin kan dræbe intracellulære bakterier, når cellerne er lysed. Gensuspension af iHOs i 500 μL af lysis buffer (Se tabellen over materialer) og manuelt dissociere organoider ved pipettering ~ 50x. Lad denne blanding være 5 min ved RT. Den resulterende opløsning 10 gange i DPBS fortyndes serielt for at generere 10-1, 10-2og 10-3 koncentrationer. Pipette 3 x 20 μl dråber af de pæne og fortyndede opløsninger på forvarmede lb agar plader. Der inkubieres natten over ved 37 °C, og der foretages kolonitælling og beregning af kolonidannende enheder (CFU). Koloni tællinger vil afspejle antallet af intracellulære bakterier, der blev frigivet under celle lyserende proces. 7. celle frysning og genoprettelse Bemærk: Som nævnt tidligere, er det muligt at kryogenisk bevare iHOs og rekonstruere dem, når det ønskes. De fast frysnings-og optøningsprocesser er skitseret nedenfor. Vælg brønde af iHOs du ønsker at fryse. Tilsæt celle løfte opløsning til brøndene og inkuperer i 40 – 50 min ved 4 °C. Den iHOs bør flyde i løsningen. Pipetter forsigtigt iHOs i et 15 mL konisk rør og lad dem slå sig ned. Fjern mediet og vask iHOs 1x med base vækstmedier (ingen vækstfaktorer). Centrifuge ved 95 x g i 2 min., Fjern supernatanten, og Udskift den med en passende volumen af celle fryse medium (se tabellen over materialer; brug mediet i henhold til producentens anvisninger), dekantering af ihos i kryogene hætteglas. Opbevar hætteglassene i en-80 °C fryser natten over for at tillade en mere gradvis nedfrysning; derefter overføre dem til flydende kvælstof opbevaring. For at rekonstruere iHOs, hurtigt afrimning et kryogen hætteglas ved 37 °C ved hjælp af en vand/perle bad; derefter forsigtigt pipette indholdet i 10 mL base vækstmedier (ingen vækstfaktorer). Tillad iHOs at bosætte og erstatte medierne med ~ 300 μL af friske base vækstmedier. Undlad at adskille iHOs manuelt. Tilsæt iHOs til kælderen membran matrix og læg dem ud som beskrevet i punkt 3.