VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua
Summary
Qui presentiamo VirWaTest, che è un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e il rilevamento di virus da campioni d’acqua nel punto di utilizzo.
Abstract
I virus escreti da esseri umani e animali possono contaminare le fonti d’acqua e rappresentare un rischio per la salute umana quando quest’acqua viene utilizzata per bere, irrigazione alimentare, lavaggio, ecc. L’indicatore classico dei batteri fecali non sempre controlla la presenza di patogeni virali, quindi il rilevamento di patogeni virali e indicatori virali è rilevante per adottare misure di mitigazione del rischio, soprattutto in scenari umanitari e in aree dove i focolai virali trasmessi dall’acqua sono frequenti.
Attualmente, diversi test commerciali che consentono la quantificazione dei batteri dell’indicatore fecale (FIB) sono disponibili per i test presso il punto di utilizzo. Tuttavia, tali test commerciali non sono disponibili per il rilevamento di virus. La rilevazione di virus nei campioni di acqua ambientale richiede la concentrazione di diversi litri in volumi più piccoli. Inoltre, una volta concentrata, la rilevazione di virus si basa su metodi quali l’estrazione dell’acido nucleico e il rilevamento molecolare (ad esempio, la reazione a catena della polimerasi [PCR]) dei genomi virali.
Il metodo qui descritto consente la concentrazione di virus da campioni d’acqua da 10 L, nonché l’estrazione di acidi nucleici virali nel punto di utilizzo, con apparecchiature semplici e portatili. Ciò consente la sperimentazione di campioni d’acqua nel punto di utilizzo di diversi virus ed è utile in scenari umanitari, nonché in qualsiasi contesto in cui non è disponibile un laboratorio attrezzato. In alternativa, il metodo consente di concentrare i virus presenti nei campioni d’acqua e la spedizione del concentrato in un laboratorio a temperatura ambiente per ulteriori analisi.
Introduction
Durante le prime fasi di qualsiasi emergenza umanitaria, l’accesso alle forniture di acqua pulita, i servizi igienico-sanitari e l’igiene sono fondamentali per la sopravvivenza delle persone colpite. Pertanto, il monitoraggio della qualità dell’acqua è una priorità per prevenire i focolai di origine idrica. È risaputo che l’acqua contaminata è spesso l’origine di malattie, ma è spesso difficile determinare le fonti di focolai virali come il virus dell’epatite E (HEV), anche con la disponibilità di metodi di laboratorio convenzionali. Il controllo della qualità dell’acqua si basa sulla quantificazione di FIB1,2,3,4. Tuttavia, è stato ampiamente documentato che non vi è alcuna correlazione tra l’assenza di FIB e la presenza di patogeni virali trasmessi dall’acqua come rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV5,6. Pertanto, l’utilizzo dei criteri di qualità dell’acqua basati sulla FIB potrebbe comportare una sottovalutazione dei rischi associati alla presenza di patogeni virali trasportati dall’acqua. La sorveglianza dei virus indicatori, come gli adenovirus umani (HAdV), o di specifici patogeni sarebbe utile per definire l’esposizione a patogeni virali e identificare la potenziale fonte di infezione umana7,8, 9,10 e nella convalida dell’efficacia delle misure igienico-sanitarie11.
Fino ad ora, il rilevamento di virus in questi scenari si basava su personale qualificato e logistica complessa. VirWaTest (virwatest.org) è finalizzato allo sviluppo di un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e la successiva rilevazione di virus da campioni d’acqua nel punto di utilizzo.
La concentrazione di virus si basa sul principio di flocculazione organica di campioni di acqua 10 L, con cui i virus vengono recuperati in piccoli volumi12,13. I floc vengono raccolti e aggiunti a un buffer che liccia i virus e impedisce la degradazione degli acidi nucleici quando sono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 settimane.
Il metodo di estrazione dell’acido nucleico si basa sull’uso di particelle magnetiche a cui gli acidi nucleici vengono adsorbiti. Possono essere trasferiti da un buffer di lavaggio all’altro e infine nel buffer di eluizione utilizzando una pipetta magnetica a cui le particelle si attaccano. Le sospensioni virali dell’acido nucleico ottenute possono essere spedite in un laboratorio di riferimento in cui il rilevamento può essere eseguito utilizzando metodi molecolari basati sulla PCR. Per ogni estrazione dell’acido nucleico, vengono testate due diverse quantità per escludere l’inibizione ezimatica originata dal campione. In alternativa, con una disponibilità minima delle apparecchiature, i test PCR possono essere eseguiti nel punto di utilizzo. L’intero processo è progettato per essere eseguito indipendentemente da un alimentatore (Figura 1).
Un saggio pcR quantitativo per rilevare l’HAdV, espulso dall’uomo e trovato in campioni di acque reflue in alte concentrazioni, è stato adattato per essere eseguito nel punto di utilizzo. HAdV sono utilizzati come indicatori virali fecali umani. Una PCR per la quantificazione del batteriofago MS2 è stata adattata anche poiché MS2 viene utilizzato in VirWaTest come controllo del processo. Il metodo può essere personalizzato per il rilevamento di qualsiasi virus di interesse.
Dopo lo sviluppo, il metodo VirWaTest è stato applicato dagli utenti in due diverse impostazioni nella Repubblica di Africa Centrale (RCA) e in Ecuador, fornendo feedback sull’applicazione del protocollo in situazioni reali.
Per quanto ne sappiamo, questa è la prima procedura che consente la concentrazione e il rilevamento di virus nel punto di utilizzo, indipendentemente da qualsiasi alimentazione, grandi apparecchiature e condizioni di congelamento/raffreddamento. Si raccomanda di raccogliere due repliche di ogni campione d’acqua al fine di ottenere risultati robusti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo VirWaTest consente la concentrazione di virus e l’estrazione di acido nucleico da campioni d’acqua nel punto di utilizzo da parte di utenti non esperti. Si tratta di un protocollo conveniente, rapido e semplice. La concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con latte scremato, con il quale il pH basso e le condizioni di alta conduttività rendono le proteine del latte scremato aggregate in floc gli adsorbienti dei virus. Quando il sedimento di floc, è facile raccoglierli, rendendo possib…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTest è stato un progetto di ricerca finanziato dal programma HIF (Humanitarian Innovation Funds) di ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Gli autori riconoscono i team WASH che hanno collaborato gentilmente a questo studio. L’analisi dei campioni in Ecuador è stata finanziata da Oxfam Ecuador e Direcciàn de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas è un borsista Serra-Hunter presso l’Università di Barcellona.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
Referencias
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
