Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales¹. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnmente utilizado, quizás debido a la simplicidad de la técnica y el concepto, es la medida de miniatura excitatoria/inhibitoria postsináptica (mE / IPSCs) bajo la tensión de la abrazadera de configuración^{2,3, 4 , 5 , 6}. mPSCs individuales representan el flujo de iones a través de receptores ionotrópicos postsinápticos (por ejemplo, receptores AMPA y GABA_A ) en respuesta a la Unión de sus respectivos neurotransmisores liberados desde la terminal presináptica ⁷ . Porque la grabación se obtiene en presencia del voltaje-bloqueado Na⁺ canal bloqueador tetrodotoxin (TTX), el lanzamiento es independiente del potencial de acción y consiste normalmente en una sola vesícula sináptica que contiene el neurotransmisor. Partiendo de este supuesto, la amplitud media de mPSCs es ampliamente utilizada como una estimación cruda del tamaño cuántico, que representa el número y la funcionalidad de los receptores postsinápticos oponerse un sitio sencillo. Por otra parte, la frecuencia de mPSCs se considera representan una combinación del número total de sinapsis que termina en la célula postsináptica y la probabilidad de liberación promedio. Sin embargo, estos parámetros no miden otra variable-multiplicativity de sinapsis, o multiplicidad sináptica — que es importante para la eficacia de la transmisión sináptica.

Basado en la teoría cuántico de la transmisión sináptica^7,8,9, la fuerza de una conexión determinada entre un par de neuronas depende de tres factores: el número de sinapsis funcionales (N), el respuesta postsináptica a la liberación de una sola vesícula sináptica (tamaño cuántico; Q) y la probabilidad de liberación de neurotransmisor (P_r). Multiplicidad de Synaptic es equivalente a N. El desarrollo de multiplicidad de synaptic o la poda de las sinapsis multiplicativas es plástico a lo largo de desarrollo y en enfermedades diferentes Estados^3,4,6,10. Por ello, caracterizar multiplicidad sináptica tiene implicaciones importantes para la comprensión de la eficacia de la transmisión sináptica en salud y enfermedad. Técnicas como la microscopia electrónica pueden identificar evidencia estructural de multiplicidad sináptica mediante la detección de múltiples contactos sinápticos origina el axón mismo sobre la misma neurona postsynaptic^{11,12, 13,14}. Sin embargo, estos multisynapses estructuralmente identificados pueden ser funcionalmente silencioso^15,16. Examen funcional precisa de N requiere técnicamente difícil métodos electrofisiológicos, como pares grabaciones de celulares que pueden determinar si una conexión determinada tiene múltiples sitios de liberación funcional y mínima enfoques de estimulación que tienen como objetivo reclutar un solo axón putativo.

En este protocolo, se describe un método simple para estimar la multiplicidad sináptica mediante la adopción de un método desarrollado originalmente por Hsia et al². Esta técnica consiste en la medición de espontánea PSC (sPSCs) y mPSCs mediante electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras, que nos permite estimar el grado de multiplicidad sináptica a través de todas las entradas a una determinada neurona.  Previamente definida, synaptic multiplicidad refleja el número de sinapsis entre la neurona pre y postsináptica dada. Si múltiples sinapsis son reclutadas en sincronía por un potencial de acción, habrá una alta probabilidad de suma temporal de PSC (es decir cuántico) individual, generando una mayor amplitud PSC.  En grabaciones de mPSC (en que los potenciales de acción son bloqueados por TTX), es baja la probabilidad de la suma temporal de los mPSCs (asíncronos). Utilizando este razonamiento, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de nacionales (con lanzamiento dependiente del potencial de acción) a la amplitud del mPSC.

Para examinar la existencia de multiplicidad Describimos cuatro experimentos y sus análisis mediante EPSCs glutamatérgica como ejemplo. Sin embargo, el mismo enfoque puede ser utilizado para la rápida transmisión de GABAergic/glycinergic (IPSCs). A continuación se describe una breve justificación para cada experimento. En primer lugar, como se explicó anteriormente, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de sEPSCs a mEPSCs. Existen dos requisitos para ello; axones 1) presinápticas deben disparar un número suficiente de potenciales de acción durante la grabación, y 2) P_r debe ser alta para que múltiples sinapsis liberan neurotransmisores a la llegada de un potencial de acción. Para cumplir estos requisitos, sEPSCs se registró por primera vez en baja Ca^{2 +} artificial líquido cerebroespinal (aCSF) y luego grabados en presencia de una concentración baja del antagonista de canales de K⁺ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar la acción potencial disparo y P_r. Entonces potencial de acción de la leña se bloquea por TTX y Pr disminuido por un voltaje Ca^{2 +} bloqueador de canales de Cd^{2 +}. La amplitud de sEPSCs (con 4AP) es comparada con la de mEPSC (con 4AP, TTX y Cd^{2 +}). En el segundo experimento, Ca^{2 +} se sustituye por equimolar Sr^{2 +} en la aCSF a desincronizar la liberación de la vesícula. Como Ca^{2 +} se requiere para la versión sincrónica de vesículas, reemplazo con Sr^{2 +} debe eliminar la sEPSCs de gran amplitud que son indicativos de la multiplicidad. En tercer lugar, mecánico, multiplicidad puede resultar de cualquiera de los dos múltiples contactos sinápticos a la misma neurona postsináptica o liberación multivesicular (es decir, múltiples vesículas lanzadas dentro de un único contacto sináptico)^17,18. Para distinguir entre los dos tipos de multiplicidad, el tercer experimento utiliza una baja afinidad, la rápida disociación antagonista competitivo de los receptores AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 para determinar si grandes sEPSC son el resultado de la suma temporal de sinapsis independiente o lanzamiento multivesicular actuando sobre una población de superposición de los receptores postsinápticos. Si los eventos de gran amplitud surgen de liberación multivesicular, γ-DGG serán menos eficaces en la inhibición de sEPSCs comparado con el más pequeño más grande, mientras que sEPSCs grandes que surgen de la suma temporal de múltiples contactos sinápticos se verán afectados de manera similar por Γ-DGG. En el cuarto experimento, un método más fisiológico se utiliza para mejorar el potencial de acción disparar, es decir, aferente estimulación sináptica. Ráfagas de actividad sináptica pueden transitorio aumento/facilitar la probabilidad de disparo y liberación de potencial de acción espontáneo de los aferentes estimuladas. Por lo tanto, este enfoque permite multiplicidad de manifestar de una manera más fisiológica.

El siguiente protocolo describe el método para realizar estos experimentos en tejido hipotalámico de ratón. Específicamente, se utilizan las neuronas de la hormona (CRH) liberando corticotropina del núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN). Describir los procedimientos para la realización de electrofisiología de celulares patch clamp y explicar los experimentos específicos para probar la multiplicidad sináptica.