台湾におけるコウモリ集団のリッサウイルスサーベイランスに関する標準的な手術手順
Summary
このプロトコルは、台湾のコウモリにおけるリッサウイルス抗原の診断試験のための標準的な実験室操作手順を導入する。
Abstract
リサウイルス属内のウイルスは人獣共通病原体であり、少なくとも7種のリサウイルス種がヒトの症例に関連している。コウモリはほとんどのリサウイルスの自然貯蔵所であるため、コウモリのリッサウイルス監視プログラムは、コウモリのこれらのウイルスの生態を理解するために2008年から台湾で行われています。このプログラムでは、非政府のコウモリ保護団体と地元の動物病対策センターが協力して、衰弱や病気で死んだコウモリやコウモリを集めました。コウモリの脳組織は壊死を介して得られ、リッサウイルス抗原および核酸の検出のための直接蛍光抗体試験(FAT)および逆転写膜ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行った。FATの場合、少なくとも2つの異なる狂犬病診断コンジュゲートが推奨されます。RT-PCRの場合、2組のプライマー(JW12/N165-146、N113F/N304R)を使用して、リッサウイルスヌクレオタンパク質遺伝子の部分配列を増幅します。この監視プログラムは、コウモリのリッサウイルスや他の人獣共通性を監視します。台湾コウモリのリサウイルスは、2016年から2017年にかけて日本のピピストレルス・アブラムス(ピピストレルス・アブラムス)の2例で発見された。これらの知見は、コウモリや他の野生動物と接触する潜在的なリスクについて、一般市民、医療専門家、科学者に知らせるべきである。
Introduction
リサウイルス属内のウイルスは人獣共通病原体である。ヒト症例1に関連する少なくとも7つのリサウイルス種がある。この属1、2、3、台湾コウモリリッサウイルス(TWBLV)4およびコタラチコウモリリサウイルス5の16種に加えて、最近コウモリで同定されているが、彼らの分類状態はまだが決定されます。
コウモリは、モコラ・リッサウイルスおよび生駒リッサウイルスを除いて、ほとんどのリッサウイルスの自然宿主であり、まだどのコウモリ1、2、3、6でも同定されていない。アジアのコウモリのリサウイルスに関する情報はまだ限られています。アジアのコウモリ(インドとタイで1つ)7、8の特徴のないリサウイルスが2つ報告されています。中国では2002年にコウモリ咬傷に関連する1例の狂犬病例が報告されたが、診断は臨床観察9によってのみ行われた。中央アジアでは、1991年にキルギスのマウス耳の小さいコウモリ(ミオティス・ブリチ)でアラバン・リッサウイルスが同定され、2001年10月にタジキスタンのひげ付きコウモリ(ミオティス・ミスタチヌス)でクジャンド・リサウイルスが同定された。南アジアでは、2015年3月にスリランカのインドのフライングキツネ(プテロプス・メディウス)でガンノールワコウモリのリサウイルスが確認された。東南アジアでは、フィリピン、タイ、バングラデシュ、カンボジア、ベトナムのコウモリに関するいくつかの血清学的研究が、可変血清原性11、12、13、14を示した。 15.イルカト・リッサウイルスは、2012年16年に中国吉林省の大きな管鼻コウモリ(ムリナ・ロイコガスター)で同定されたが、東アジアのコウモリ集団におけるリッサウイルスの正確な種と場所は不明のままである。
台湾のコウモリ集団におけるリッサウイルスの存在を評価するために、直接FATとRT-PCRの両方を用いた監視プログラムが開始された。台湾コウモリのリサウイルスは、2016~2017年に日本ピピストレルス・アブラムス(ピピストレルス・アブラムス)4例の2例で同定された。本論文では、台湾におけるコウモリ集団のリサウイルス監視に関する実験室標準手術手順を紹介する。本研究室におけるコウモリリサウイルス診断のフローチャートを図1に示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
この実験室の標準的な操作手順(SOP)は台湾のリッサウイルス抗原の存在のためのコウモリのサンプルをテストするためのシリアルプロセスを提供する。重要なステップは、FATとRT-PCRの雇用が含まれます。適切なサンプルの選択とウイルスの正常な単離も重要です。さらに、コウモリのリサウイルスのモニタリング中にいくつかのトラブルシューティングが行われました。主な違いは、ターゲ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この研究の間に彼らの援助のためにティエン・チェン・リー、イ・タン・リン、チア・ジュン・ツァイ、およびヤ・ラン・リーに感謝する。この研究は、動植物衛生検査検疫局、農業評議会、エグゼクティブ元、台湾の第107AS-8.7.1-BQ-B2(1)の助成金によって支援されました。
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
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