ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

リポアズパイレーツおよび腹部形成術サンプルの使用は、ラトガース大学の機関審査委員会(IRB)によって承認されました – ニューアークキャンパス。 1. 組織培養媒体の調製 ASCを分離する前に、500mLの組織培養媒体を無菌に調製します。培養媒体を調製するには、10%定義された胎児子牛血清(FCS)とペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/100 mL)を、高グルコースと2mM L-グルタミンを含むダルベッコの最小限の必須メディア(DMEM)に加えます。メディアは4 °Cで最大3週間保存でき、常に温暖(室温から37°Cまで)を使用する必要があります。 幹細胞の培養に別の媒体が好ましい場合は、代わりにそのメディアを準備します。 2. 脂肪組織からのASCの分離 脂肪吸引または腹部形成術サンプルを得る。IRBの承認に従って、様々な外科的処置に従って組織を廃棄するようなサンプルを得る。外科医が組織を取り除いたどの血管で実験室に脂肪吸引器を輸送;手術室の標本袋または容器の腹部形成術のサンプルを輸送する。 すぐに処理しない場合は、室温で最大6時間、または4°Cで24時間保存します。前述の時間を超えて処理された組織サンプルは、細胞収率が低下する可能性が高い。1x滅菌リン酸緩衝生理食塩糸を添加して、腹部形成術サンプルを湿らせておいてください。 この時点以降、無菌条件下で層流フード内のすべてのステップを実行します。個人的な保護のために手袋を着用してください。近くに10%の漂白剤、70%のエタノール、ペーパータオルを保管して、生物学的な流出を迅速にクリーンアップします。余分な組織を生物医学廃棄物として処分する。 サンプルを < 1 mm 個にミンチします。腹部形成術ブロックが大きすぎて作業できない場合は、ミンチする前にブロックから組織の管理可能なサイズを切り取ります。腹部形成術組織を滅菌100mmプレートのふたに移す。滅菌針を使用して組織を所定の場所に保持し、滅菌メスを使用して、バルク組織を切断または穏やかに細断することによって破片をミンチオフします。 このステップは、一般的にリポアズパイレーツには必要ありません。しかし、リポアズパイレーツで大きな組織塊が観察された場合は、滅菌鉗子でそのような塊を除去し、上記のように処理する。 組織を新鮮なチューブに移し、サンプルを5~6回反転または振って、すべての層の混合を確実にします。オプション:リポアシテリングが完全に落ち着いた場合は、混合する前にオイル層を取り外して廃棄します。 2.5~5 mLの組織を100mm真空ガスプラズマ処理組織培養プレート(材料の表)に移す。新鮮な遠心管に注いでサンプルの体積を測定します。必要に応じて、滅菌スパチュラを使用して組織の移入を支援します。 同等の体積の組織培養媒体をプレートに加える。プレートを軽く旋回して内容物を混ぜます。 プレートの基部に十分な数の細胞が見つかるまで、5%CO2で37°Cでパテをインキュベートします。時間が経つにつれて、細胞は組織の中からプレート表面に移動し、その時点でプラスチックに付着します。彼らは組織を出ると、細胞は組織片の周りに小さなクラスターとして現れます。 24時間ごとに、できるだけ多くの流体を取り除き、同様の量のメディアに交換します。可能であれば、組織の断片を所定の場所に置いておきます。 十分な数の細胞がプレート上に表示されたら(プレート上の>15~25細胞の>10個のクラスター)、または7日後に、より早い方で残りの組織をすべて取り除きます。 組織培養媒体中のASCを70%のコンフルエンスに達するまで、またはクラスターが密になるまで(プレート上の細胞の5つの密なクラスター、それぞれ直径が約500μm)、その時点で細胞を通過させる。 3 ASCの文化 親プレートが約70%のコンフルエンシーに達したときのASCの通過。ASC文化の不一伴性を避けるように注意してください。 1xリン酸緩衝生理食塩糸でプレートを軽くすりすり、接着細胞をトリプシンします。細胞をトリプシン化するには、リン酸緩衝生理食塩糸を吸引し、各プレートに0.25TAでトリプシンを1mL加え、37°Cで5分間インキュベートします。5分後、顕微鏡検査により付着解除を確認する。細胞がまだ付着している場合は、さらに5分間インキュベーターに細胞を戻します。 プレートに少量のメディア(トリプシン体積の約25%)を加えてトリプシンを非アクティブにし、メディア/トリプシンを使用してプレートのベースを軽く洗浄します。プレートを洗浄するには、プレートをわずかな角度で保持し、プレートの上部からメディア/トリプシンをゆっくりと下にピペットし、プレートから毎週取り付けたセルを緩めます。細胞は1:3比で再めっきするか、プレートあたり120,000〜500,000細胞の密度で播種することができます。 細胞数に基づいて播種する場合は、トリプシン/メディアをプレートから円錐形遠心管に移し、300 x gで遠心分離して細胞を7分間ペレット化し、組織培養媒中の細胞を再中断し(初期プレート当たり約1mL)、播種前に細胞を数える。細胞を数えるには、細胞懸濁液の10μLをヘモサイトメーターに移し、グリッドの各コーナーの4 x 4象限に存在する細胞をカウントする。これらの値を平均化し、値に 104を掛けてセル番号を計算します。 細胞を播種する前に、プレートにメディアを追加します。セルをドロップワイズで追加し、プレートを旋回してプレート全体の均等な分布を確保します。注:3つの通路の後、接着細胞は非対称で紡錘状に見えるはずです。ASC表現型および挙動は、フローサイトメトリーおよび分化アッセイを用いて確認することができる。 フローサイトメトリーと分化アッセイを用いたASC表現型と挙動の確認 フローサイトメトリー 上述のように細胞を収集し、ペレットする。1xリン酸緩衝生理食塩糸でペレットを洗浄し、抗体の製造業者推奨体積で細胞にラベルを付けます。フローサイトメトリーのための詳細なプロトコルは、一般的な実験室の手順は、ここで12、14、15を見つけることができます。 ASC表現型を確認するには、次のサーフェスマーカーパネルを選択します: CD14、CD31、CD34、CD45、およびCD106の負。CD29、CD36、CD44、CD73、CD90、および CD10516、17、18、19の場合は正の値です。CD36の存在とCD106の不在は、骨髄由来MSC20からASCを識別する。 差別化アッセイ: MSC 差別化キットを使用して多系統分化を確認します。キットは、脂肪原性、骨原性、軟骨分化能力を確認するために、複数のメーカーから入手可能です。3週間、または形態学的分化が観察されるまで、メーカーのプロトコルに従って3~4日ごとにキット提供のメディアを交換します。 複数の通路の細胞を培養します。必要な通路の数は、アプリケーションによって異なります。各通路で、前述の細胞表面マーカーを用いてMSC細胞形態と表現型を確認し、多系分化能力が失われていないことを確認する。拡張の可能性はドナー間で異なりますが、ほとんどのサンプルは最大6〜9の通路のために拡張することができます。 将来の使用のために細胞を保存し、液体窒素に保存します。 4 ASCの凍結保存 凍結溶液AおよびBの10 mLを準備する。 凍結溶液Aの場合は、高グルコースのDMEMに20Sを加えます。 凍結溶液Bの場合、高グルコースのDMEMに20Sと20%ジメチルスルフィド(DMSO)を加えます。 細胞を300 x gで5分間遠心分離してペレットを行い、少量の凍結溶液Aで細胞を再休止し、ステップ3.3.1のようにヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントする。 500,000 ~ 1,000,000 セル/mL の最終的なセル濃度に達するために、セルが再懸濁される最終的な体積を計算します。凍結溶液Aを使用して、その最終容積の50%でペレットを再サスペンドします。チューブを攪拌しながら、凍結溶液Bの等量をゆっくりと加え、最終的な細胞濃度に達する。 直ちに1~2mLの凍結で細胞を凍結する。クリオビアーを制御レート冷凍庫または-80°Cに入れた冷凍容器に入れ、温度を1°C/分下げます。制御された凍結(凍結容器のために一晩)に続いて、細胞を液体窒素に移し、長期保存する。