Den direkte hurtige immun histokemiske test (DRIT) tilbyder en verdensorganisation for dyresundhed og Verdenssundhedsorganisationen (OIE/WHO) anerkendt alternativ til den direkte fluorescerende antistof (DFA) test for rabies diagnose. Denne test giver mulighed for felt-baserede applikationer, der kan udføres i ca 1 h på hjernen indtryk ved hjælp af lys mikroskopi.
Laboratoriebaseret overvågning er en integrerende del af forebyggelsen, kontrollen og ledelsen af rabies. Mens DFA er den gyldne standard for rabies diagnose, er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker til at forbedre rabies overvågning, især i udviklingslandene. Her præsenterer vi en standardprotokol for DRIT som en alternativ, laboratorium eller felt-baseret test option, der bruger lys mikroskopi i forhold til DFA. Touch indtryk af hjernevæv indsamlet fra mistænkte dyr er fastsat i 10% Buffered formalin. Den DRIT bruger rabiesvirus-specifikke monoklonale eller polyklonale antistoffer (konjugeret til biotin), en streptavidin-peroxidase enzym, og en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) til at detektere virale indeslutninger i inficerede væv. I ca. 1 time kan en hjerne vævsprøve testes og fortolkes af DRIT. Evaluering af mistænkte dyr hjerner testet fra en række forskellige arter i Nordamerika, Asien, Afrika, og Europa har illustreret høj følsomhed og specificitet af DRIT nærmer 100% med resultater i forhold til DFA. Siden 2005, de Forenede Staters Department of Agriculture Wildlife Services (USDA WS) program har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats ved hjælp af DRIT at teste > 94000 prøver indsamlet fra dyreliv i strategiske rabies Management områder . Den DRIT giver en kraftfuld, økonomisk værktøj til rabies diagnose, der kan bruges af laboratorierne og felt biologer til at forbedre nuværende rabies overvågning, forebyggelse og kontrolprogrammer globalt.
Mens DFA er den mest udbredte test for rutinemæssig rabies diagnose1, kan omkostningerne ved at købe og vedligeholde et fluorescerende mikroskop begrænse til udviklingslande2,3,4 og for brede, storstilet forbedrede rabies overvågningsprogrammer3,4. Desuden kræver DFA evnen til at køle prøver under fiksering og til at inkubere prøver over omgivende temperatur under antistof-antigen-reaktionerne, hvilket kan være en betydelig forhindring i lande uden passende infrastruktur. På grund af de begrænsninger, der er forbundet med moderne DFA-testning, har den globale virkning af rabies længe været undervurderet5.
I denne forbindelse er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker for at forbedre overvågningen af rabies globalt, især i udviklingslandene. Den DRIT-protokol, der præsenteres her, tilbyder et laboratorium eller felt baseret test alternativ til DFA, der bruger let mikroskopi og ikke kræver køling eller laboratorie inkubation under testen6. Den DRIT og DFA er ens i, at begge teknikker bruger touch indtryk af hjerne prøver indsamlet fra potentielt rabiat dyr. Men det første trin i DRIT bruger formalin som en historisk fixativ for prøver, som inaktiverer rabiesvirus. Dette giver en betydelig forbedring af biosikkerheden i forhold til acetone anvendes til at fastsætte prøver i DFA protokol3, hvilket er vigtigt ikke kun i laboratoriet, men måske endnu mere i marken-baserede eller decentrale Lab miljøer. Til dato, den drit viser følsomhed og specificitet svarende til DFA2,7,8,9.
Siden 2005, USDA WS programmet har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats i Nordamerika ved hjælp af DRIT som en del af en omfattende Wildlife rabies Management program10. Øget rabies overvågning anvendes som et supplement til eksponeringsbaseret folkesundhedsmæssig overvågning og tester primært vildtlevende Meso-kødædende arter, herunder vaskebjørne (Procyon lotor), stribede skunks (mephitis mephitis), grå ræve ( Urocyon cinereoargenteus), røde ræve (Vulpes vulpes), og Coyoter (Canis latrans), der ikke har været involveret i en menneskelig eller indenlandsk dyrs eksponering. Dyrekroppe, der anvendes til testning, blev indsendt til USDA WS gennem øget rabies overvågningsindsats og bestod af rabies vektorarter, der er: syg eller mærkelig skuespil; fundet død, vej-dræbt, eller en plage; og ikke er forbundet med en eksponering af mennesker eller dyr i hjemmet. Den DRIT giver en rabies diagnostisk test, der kan være ansat af uddannede felt biologer med ringe eller ingen laboratorie erfaring til at forbedre rabies overvågning og reducere den finansielle byrde og arbejdsbyrden for den offentlige sundhed diagnostiske laboratorier10. Den grundlæggende DRIT-træning for USDA WS-medarbejdere tager typisk 1,5 til 2 dage, hvilket omfatter ca. 4 timer i klasseundervisning, der dækker grundlæggende principper for biosikkerhed, metoder til indsamling af prøver og DRIT-processerne samt > 8 timer laboratorie tiden, hvor testen udføres. Uddannelsesmuligheder har været til rådighed for USDA WS og program samarbejdsvillige gennem centre for Disease Control og forebyggelse (CDC), Lyssa LLC, og Wistar Institute.
Inden for strategiske Management områder, har USDA WS testet over 94.000 Wildlife prøver ved hjælp af DRIT og har opdaget mere end 1.850 rabiat prøver, der ville have sandsynligvis gået uopdaget afhængige kun ved eksponering baseret folkesundheden test af mistænkte dyr. Forbedrede rabies overvågningsdata leveret af DRIT resultater er afgørende for at give en mere komplet tidsmæssig og rumlig repræsentation af rabies på landskabet til støtte for oral rabiesvaccination programmer for dyreliv i hele USA10, 11. Tilsvarende, provins Wildlife agenturer i Canada har indarbejdet DRIT i stor skala dyreliv rabies overvågning indsats i tandem med deres offentlige sundhed programmer med succes8. Både USDA WS og Canadian DRIT overvågningsprogrammer har brugt nationale referencelaboratorier til at bekræfte rabies ved DFA og til at udføre viral variant indtastning som relevant8. Desuden, USDA WS biologer sende 10% af negative eksemplarer til DFA bekræftelse til referencelaboratorier og siden 2008, har deltaget i halvårlige DRIT præstationstest leveret af Wisconsin State Laboratory hygiejne, som en del af standard kvalitetssikringsforanstaltninger.
Målet med denne metode er at tilbyde en alternativ tilgang til rabies diagnostisk testning, der kan gøres i decentrale laboratorier, i marken, eller i områder uden rutinemæssig adgang til elektronmikroskopi.
DRIT er en fleksibel metode, der er velegnet til felt baseret overvågning til påvisning af tilstedeværelsen af rabiesvirus, som kan anvendes i decentraliserede laboratorieområder. Selv om det er muligt at gennemføre hele testen i en felt-baseret indstilling som på bagklap af en lastbil, er det ideelt at have en lille, indendørs rum dedikeret til DRIT på grund af kemiske, udstyr og forsyning opbevaring spørgsmål. Desuden skal overholdelse af alle gældende føderale, statslige og lokale love, og regler for kemisk brug og bortskaffelse overvejes. I øjeblikket, USDA WS har 15 DRIT faciliteter til at teste prøver fra 17 stater. USDA WS DRIT-faciliteterne er etableret i samarbejde med universitets-og stats folkesundheds laboratorier, i udpegede lokaler inden for større faciliteter og i lukkede påhængskøretøjer, der er blevet eftermonteret og ombygget til at fungere som mobile prøvnings enheder i tilfælde af et akut udbrud svar, hvor øget rabies overvågning test med øjeblikkelig behandlingstid er kritisk (figur 5).
Mens testen har været vellykket ved hjælp af hjernestammen materiale af varierende kvalitet, frisk hjernestammen væv uden vævs nedbrydning er optimal. Da nedbrydning, udtørring eller likvefaktion forekommer, mindskes prøve kvaliteten, og testen kan detektere mere uspecifik farvning, som kan forvirre resultaterne. Denne observation er den samme mellem DFA og DRIT2. Hjernestammen/CNS skal indsamles så hurtigt som muligt og derefter opbevares frosset (-20 °C) indtil testning.
Typisk, de fleste USDA WS faciliteter proces fra 12 til 24 slides på én gang i løbet af en DRIT session, herunder en positiv kontrol og en negativ kontrol, der er blevet bekræftet via DFA. Positive og negative kontroller udgør et referencepunkt for hver enkelt DRIT kørsel for at sikre, at testen blev gennemført, og for at bekræfte, om der opstår fortolkningsspørgsmål på prøve diasene. Hvis en prøve ikke er bestemt til at have et klart positivt eller negativt udfald, mærkes den som en ubestemt og afprøvet anden gang af DRIT. Hvis denne prøve ikke er en klar positiv eller negativ efter to DRIT-tests, sendes den til et referencelaboratorium for DFA eller relateret testning.
Som med enhver diagnostisk test, ‘ Trouble Shooting ‘ er nyttigt med uventede resultater. For eksempel, hvis en DRIT kørsel mislykkes (dvs. den positive kontrol ikke udviser + 3 eller + 4 farvning intensitet og antigen fordeling), sikre alle kemikalier og reagenser er ikke udløbet. Vi har fundet ved hjælp af en nyåbnet flaske hydrogenperoxid på mindst én gang om ugen er nyttigt at hjælpe med at forhindre ikke-specifik farvning gennem oxidation af hjernevæv. Derudover anbefaler vi udskiftning af acetatbuffer mindst én gang om året som minimum, uanset den mærkede udløbsdato.
Der er en række fordele ved DRIT over DFA, herunder lavere omkostninger, evne til at udføre testen uden for et centraliseret laboratorium, behov for kun lys mikroskopi i stedet for et fluorescerende mikroskop, og den relativt ligetil træning proces for mennesker, som administrerer og læser testen2,3,4. Disse fordele, kombineret med følsomhed og specificitet af drit, der er sammenlignelige med DFA2,7,8,9 har allerede bevist, at testen fungerer som et vigtigt redskab i bred skala forbedrede rabies overvågningsprogrammer8,10 i Nordamerika. Derudover har DRIT potentiale til at give mulighed for øget overvågning og mere hurtig testning i udviklingslande eller andre områder med begrænsede ressourcer, især efter den seneste OIE/WHO-vejledning som en anbefalet test.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender alle USDA Wildlife Services personale, der i øjeblikket eller har tidligere indsamlet øget rabies overvågning prøver og har gennemført DRIT for rabies diagnose. På samme måde anerkender vi de mange medarrangører, der hjælper os med forbedret indsamling af rabies overvågning. Vi takker også centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og Wistar Institute for adgang til kritiske reagenser, der kræves for at gennemføre DRIT og for at give uddannelsesmuligheder. Derudover sætter vi pris på den bekræftende diagnose og teknisk assistance fra centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og af Wadsworth Center med New Yorks sundhedsministerium. Brug af kommercielle produkter er kun til sammenligningsformål og udgør ikke en påtegning.
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | A6926 | |
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz | Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/) | s140 | |
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package | Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/) | PN110 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/) |
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-823-2A | BD Manufacturer Number 309604 |
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent | Multiple Vendors | ||
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01BLU | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution) |
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24×60 | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 12-553-465 | Corning Manufacturer Number 2975246 |
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 07-200-300 | Corning Manufacturer Number 4863 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-959-70C | Corning Manufacturer Number 352097 |
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 08-772-5 | Corning Manufacturer Number 353910 |
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 09-719D | |
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | CS401-1D | |
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 14-827-122 | Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up |
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 102092-122 | Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences |
Formalin, Buffered, 10%, 4L | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SF100-4 | Available each or in case of 4 |
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF9930E | |
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | SH30256LS | Alternative dry powder product can be used |
Hydrogen Peroxide, 3% | Multiple Vendors | Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc. | |
Lens Microscope Objective 20X and 40X | Multiple Vendors | ||
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G | Daigger Scientific (https://www.daigger.com) | EF8481 | Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection |
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel) | AMD Next (www.amdnext.com) | 999112314 | Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel |
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | D119-500 | |
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL | SeraCare (https://www.seracare.com/) | 5550-0001 | KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38 |
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS) | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P3813 | Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs |
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies | Store at 4 degrees C | ||
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-1 | VWR Manufacturer Number 89091-220 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-10 | VWR Manufacturer Number 89091-106 |
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 7078D-5 | VWR Manufacturer Number 89091-484 |
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above) | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 22-050-201 | Thermo Scientific Manufacturer Number 72504 |
Slide Holders, 24-place | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-868 | Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors |
Specimen Tin Boxes, 1/2oz | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 101412-452 | Supplemental equipment for storage of brain tissue samples |
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock | Multiple Vendors | Supplemental equipment | |
Tissue-Tek Slide Staining Kit | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 25608-902 | Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors |
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL | Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/) | P1754 | Also available in 25mL, 1L and 1G volumes |
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 53497-055 | |
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 89038-272 | Supplemental equipment for proper PPE |
Water, Deionized (20L) | VWR, part of Avantor (https://vwr.com) | 10806-022 | |
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL | Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html) | 06-408C | DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884 |
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm | Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html) | 2-140 | |
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G | Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/) | 1147T01WHT | Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin) |