Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila
Summary
Qui, presentiamo un metodo per registrare le contrazioni muscolari embrionali negli embrioni della Drosophila in modo non invasivo e orientato ai dettagli.
Abstract
Le contrazioni muscolari coordinate sono una forma di comportamento ritmico visto all’inizio durante lo sviluppo negli embrioni della Drosophila. I circuiti di feedback sensoriale neuronale sono necessari per controllare questo comportamento. La mancata produzione del modello ritmico delle contrazioni può essere indicativa di anomalie neurologiche. In precedenza abbiamo scoperto che i difetti nella proteina O-mannosilation, una modificazione delle proteine post-traduzionale, influenzano la morfologia degli assoni dei neuroni sensoriali e provocano contrazioni muscolari coordinate anormali negli embrioni. Qui, presentiamo un metodo relativamente semplice per registrare e analizzare il modello delle contrazioni muscolari peristalitiche mediante l’imaging dal vivo di embrioni in fase avanzata fino al punto di schiusa, che abbiamo usato per caratterizzare il fenotipo di contrazione muscolare delle proteine Mutanti O-mannosyltransferase. I dati ottenuti da queste registrazioni possono essere utilizzati per analizzare le onde di contrazione muscolare, tra cui la frequenza, la direzione di propagazione e l’ampiezza relativa delle contrazioni muscolari in diversi segmenti del corpo. Abbiamo anche esaminato la postura del corpo e sfruttato un marcatore fluorescente espresso specificamente nei muscoli per determinare con precisione la posizione della linea mediana dell’embrione. Un approccio simile può anche essere utilizzato per studiare vari altri comportamenti durante lo sviluppo, come il rotolamento degli embrioni e la schiusa.
Introduction
La contrazione muscolare peristaltica è un comportamento motorio ritmico simile al camminare e nuotare negli esseri umani1,2,3. Le contrazioni muscolari embrionali osservate negli embrioni in fase avanzata della Drosophila rappresentano un esempio di tale comportamento. La Drosophila è un eccellente organismo modello per studiare vari processi di sviluppo perché lo sviluppo embrionale nella Drosophila è ben caratterizzato, relativamente breve e facile da monitorare. L’obiettivo generale del nostro metodo è quello di registrare e analizzare attentamente il modello ondulatorio di contrazione e rilassamento dei muscoli embrionali. Abbiamo usato un approccio semplice e non invasivo che offre una visualizzazione dettagliata, la registrazione e l’analisi delle contrazioni muscolari. Questo metodo può anche essere potenzialmente utilizzato per studiare altri processi in vivo, come il rotolamento embrionale visto negli embrioni in fase avanzata appena prima della schiusa. In studi precedenti, le contrazioni muscolari embrionali sono state analizzate per lo più in termini di frequenza e direzione1,2. Per stimare l’entità relativa delle contrazioni man mano che progrediscono lungo l’asse del corpo nella direzione anteriore o posteriore, abbiamo usato embrioni che esprimono GFP in modo specifico nei muscoli. Questa analisi fornisce un modo più quantitativo per analizzare le contrazioni muscolari e per rivelare come la postura del corpo negli embrioni viene mantenuta durante una serie di onde peristaliche di contrazioni muscolari.
Le contrazioni muscolari peristaltiche sono controllate da circuiti centrali del generatore di pattern (CPG) e comunicazioni tra neuroni del sistema nervoso periferico (PNS), il sistema nervoso centrale (SNC) e muscoli4,5. La mancata produzione di normali contrazioni muscolari peristaliche può portare a difetti come la mancata schiusa2 e la locomozione larvale anormale6 e può essere indicativa di anomalie neurologiche. L’imaging dal vivo di onde peristalitiche di contrazione muscolare e l’analisi dettagliata dei fenotipi di contrazione possono aiutare a scoprire i meccanismi patogeni associati ai difetti genetici che interessano i muscoli e i circuiti neurali coinvolti nella locomozione. Recentemente abbiamo usato questo approccio per studiare i meccanismi che provocano una postura del corpo torsione fenotipo di proteino O–mannosyltransferase (POMT) mutanti7.
Protein O-mannosylation (POM) è un tipo speciale di modifica post-traduzionale, dove uno zucchero mannoso viene aggiunto ai residui di serine o di treonina di proteine della via secretoria8,9. I difetti genetici nella POM causano distrofie muscolari congenite (CMD) negli esseri umani10,11,12. Abbiamo studiato i meccanismi causali di queste malattie usando la Drosophila come sistema modello. Abbiamo scoperto che gli embrioni con mutazioni nella proteina della Proteina di Drosophila O-mannosyltransferasis geni POMT1 e POMT2 (a.k.a. addominale ruotato (rt) e contorti (tw )) mostrano un spostamento (“rotazione”) di segmenti del corpo, che si traduce in una postura anormale del corpo7. È interessante notare che, questo difetto ha coinciso con la fase di sviluppo quando le contrazioni muscolari peristaliche diventano prominenti7.
Poiché la postura anomala del corpo negli embrioni mutanti di POM si verifica quando la muscolatura e l’epidermide sono già formate e sono iniziate onde peristaliche di contrazioni muscolari coordinate, abbiamo ipotizzato che la postura anormale del corpo potrebbe essere il risultato di un muscolo anormale contrazioni piuttosto che un difetto nella morfologia muscolare o/e epidermide7. I CMD possono essere associati a contrazioni muscolari anormali e difetti postura1,e quindi l’analisi del fenotipo della postura nei mutanti PSIMT Drosophila può chiarire i meccanismi patologici associati a distrofie muscolari . Al fine di studiare la relazione tra il fenotipo della postura del corpo dei mutanti Posophila POMT e le possibili anomalie nelle onde peristaliche delle contrazioni muscolari, abbiamo deciso di analizzare le contrazioni muscolari in dettaglio utilizzando un approccio imaging.
La nostra analisi delle onde di contrazione peristale negli embrioni di Drosophila ha rivelato due modalità di contrazione distinte, designate come onde di tipo 1 e di tipo 2. Le onde di tipo 1 sono onde semplici che si propagano da anteriore a posteriore o viceversa. Le onde di tipo 2 sono onde bifasiche che iniziano all’estremità anteriore, si propagano a metà della direzione posteriore, si fermano momentaneamente, formando una contrazione statica temporale, e poi, durante la seconda fase, vengono spazzate da una contrazione peristale che propaga in avanti dall’estremità posteriore. Gli embrioni selvatici di tipo selvaggio normalmente generano una serie di contrazioni che consiste di circa 75% tipo 1 e 25% di tipo 2 onde. Al contrario, gli embrioni mutanti POMT generano onde di tipo 1 e tipo 2 a frequenze relative approssimativamente uguali.
Il nostro approccio può fornire informazioni dettagliate per l’analisi quantitativa delle contrazioni muscolari e del rotolamento degli embrioni7. Questo approccio potrebbe anche essere adattato per l’analisi di altri comportamenti che coinvolgono contrazioni muscolari, come la schiusa e la scansione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro metodo fornisce un modo quantitativo per analizzare importanti comportamenti embrionali durante lo sviluppo, come le onde di contrazione muscolare peristale, tra cui la periodicità delle onde, l’ampiezza e il modello, nonché l’effetto delle onde sul rotolamento e sulla postura. Questo può essere utile nelle analisi di diversi mutanti per studiare il ruolo di geni specifici nella regolazione di questi e altri comportamenti durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo utilizzato cambiamenti nell’intensità del marc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 e CONACYT 2012-037 (S) a VP.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referencias
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