Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo
Summary
Hier stellen wir eine Methode vor, um embryonale Muskelkontraktionen in Drosophila-Embryonen nicht-invasiv und detailorientiert aufzuzeichnen.
Abstract
Koordinierte Muskelkontraktionen sind eine Form des rhythmischen Verhaltens, das früh während der Entwicklung bei Drosophila-Embryonen beobachtet wird. Um dieses Verhalten zu steuern, sind neuronale sensorische Rückkopplungskreise erforderlich. Wenn das rhythmische Muster von Kontraktionen nicht erzeugt wird, kann dies auf neurologische Anomalien hindeuten. Wir haben zuvor festgestellt, dass Defekte in der Protein-O-Mannosylierung, einer posttranslationalen Proteinmodifikation, die Axonmorphologie sensorischer Neuronen beeinflussen und zu abnormalen koordinierten Muskelkontraktionen in Embryonen führen. Hier stellen wir eine relativ einfache Methode zur Aufzeichnung und Analyse des Musters peristaltischer Muskelkontraktionen durch Live-Bildgebung von Embryon im späten Stadium bis zum Schraffur, die wir verwendet, um die Muskelkontraktion Phänotyp des Proteins charakterisieren O-mannosyltransferase Mutanten. Daten aus diesen Aufzeichnungen erhalten können verwendet werden, um Muskelkontraktionswellen zu analysieren, einschließlich Frequenz, Richtung der Ausbreitung und relative Amplitude von Muskelkontraktionen an verschiedenen Körpersegmenten. Wir haben auch die Körperhaltung untersucht und einen fluoreszierenden Marker genutzt, der speziell in den Muskeln ausgedrückt wird, um die Position der Embryo-Mittellinie genau zu bestimmen. Ein ähnlicher Ansatz kann auch verwendet werden, um verschiedene andere Verhaltensweisen während der Entwicklung zu studieren, wie embryonalieren und schlüpfen.
Introduction
Peristaltische Muskelkontraktion ist ein rhythmisches motorisches Verhalten ähnlich wie Gehen und Schwimmen beim Menschen1,2,3. Embryonale Muskelkontraktionen, die in Drosophila-Embryonen im späten Stadium beobachtet werden, sind ein Beispiel für ein solches Verhalten. Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, um verschiedene Entwicklungsprozesse zu studieren, da die embryonale Entwicklung in Drosophila gut charakterisiert, relativ kurz und leicht zu überwachen ist. Das übergeordnete Ziel unserer Methode ist es, das wellenartige Muster der Kontraktion und Entspannung der embryonalen Muskeln sorgfältig aufzuzeichnen und zu analysieren. Wir verwendeten einen einfachen, nicht-invasiven Ansatz, der eine detaillierte Visualisierung, Aufzeichnung und Analyse von Muskelkontraktionen bietet. Diese Methode kann möglicherweise auch verwendet werden, um andere In-vivo-Prozesse zu untersuchen, wie z. B. embryonale Walzen, die in späten Embryonen kurz vor dem Schlüpfen beobachtet wurden. In früheren Studien wurden embryonale Muskelkontraktionen meist in Bezug auf Häufigkeit und Richtunganalysiert 1,2. Um das relative Ausmaß der Kontraktionen zu schätzen, während sie entlang der Körperachse in vorderer oder hinterer Richtung voranschreiten, haben wir Embryonen verwendet, die GFP spezifisch in muskeln ausdrücken. Diese Analyse bietet eine quantitativere Möglichkeit, Muskelkontraktionen zu analysieren und zu zeigen, wie die Körperhaltung in Embryonen während einer Reihe peristaltischer Wellen von Muskelkontraktionen aufrechterhalten wird.
Peristaltische Muskelkontraktionen werden durch zentrale Mustergenerator (CPG) Schaltungen und Kommunikation zwischen Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS), des zentralen Nervensystems (ZNS) und Muskeln4,5gesteuert. Wenn keine normalen peristaltischen Muskelkontraktionen auftreten, kann dies zu Defekten wie dem Versagen der Luke2 und der abnormalen Larvenfortbewegung6 führen und kann auf neurologische Anomalien hinweisen. Live-Bildgebung von peristaltischen Wellen der Muskelkontraktion und detaillierte Analyse von Kontraktion Phänotypen können helfen, pathogene Mechanismen im Zusammenhang mit genetischen Defekten, die Muskeln und neuronale Schaltkreise in der Fortbewegung beteiligt aufzudecken. Wir haben vor kurzem diesen Ansatz verwendet, um Mechanismen zu untersuchen, die zu einem Körperhaltungs-Torsion-Phänotypvon protin O–mannosyltransferase (POMT) Mutanten 7 führen.
Protein-O-Mannosylierung (POM) ist eine spezielle Art der posttranslationalen Modifikation, bei der ein Mannosezucker zu Serin- oder Threoninrückständen von sekretorischen Signalwegproteinen8,9hinzugefügt wird. Genetische Defekte in POM verursachen angeborene Muskeldystrophien (CMD) beim Menschen10,11,12. Wir untersuchten die ursächlichen Mechanismen dieser Krankheiten mit Drosophila als Modellsystem. Wir fanden heraus, dass Embryonen mit Mutationen in Drosophila-Protein O-mannosyltransferase Gene POMT1 und POMT2 (auch als rotierter Bauch (rt) und verdreht (tw)) Verschiebung (“Rotation”) von Körpersegmenten, was zu einer abnormalen Körperhaltung führt7. Interessanterweise fiel dieser Defekt mit dem Entwicklungsstadium zusammen, wenn peristaltische Muskelkontraktionen prominent werden7.
Da abnorme Körperhaltung in POM-mutierten Embryonen entsteht, wenn muskulös und epidermis bereits gebildet sind und peristaltische Wellen koordinierter Muskelkontraktionen begonnen haben, vermuteten wir, dass eine abnorme Körperhaltung eine Folge abnormaler Muskeln sein könnte. Kontraktionen statt eines Defekts in der Muskel- oder/und Epidermismorphologie7. CMDs können mit abnormalen Muskelkontraktionen und Haltungsfehlern in Verbindung gebracht werden13, und daher kann die Analyse des Haltungsphänotyps bei Drosophila POMT-Mutanten pathologische Mechanismen im Zusammenhang mit Muskeldystrophien aufklären . Um den Zusammenhang zwischen dem Körperhaltungsphänotyp von Drosophila POMT Mutanten und möglichen Anomalien in peristaltischen Wellen von Muskelkontraktionen zu untersuchen, haben wir beschlossen, Muskelkontraktionen im Detail mit einem bildgebenden Ansatz.
Unsere Analyse von peristaltischen Kontraktionswellen in Drosophila-Embryonen ergab zwei unterschiedliche Kontraktionsmodi, die als Typ-1- und Typ-2-Wellen bezeichnet wurden. Typ-1-Wellen sind einfache Wellen, die sich von vorn zu hintergründ oder umgekehrt ausbreiten. Typ-2-Wellen sind biphasische Wellen, die sich am vorderen Ende antreiben, sich auf halbem Weg in die hintere Richtung ausbreiten, kurzzeitig anhalten, eine zeitliche statische Kontraktion bilden und dann, während der zweiten Phase, von einer peristaltischen Kontraktion gefegt werden, die sich fortausbreitet. vom hinteren Ende nach vorne. Wildtyp-Embryonen erzeugen normalerweise eine Reihe von Kontraktionen, die aus etwa 75 % Typ-1- und 25 %-Typ-2-Wellen bestehen. Im Gegensatz dazu erzeugen POMT-mutierte Embryonen Typ-1- und Typ-2-Wellen bei annähernd gleichen relativen Frequenzen.
Unser Ansatz kann detaillierte Informationen für die quantitative Analyse von Muskelkontraktionen und Embryorollen7liefern. Dieser Ansatz könnte auch für Analysen anderer Verhaltensweisen mit Muskelkontraktionen, wie Schlüpfen und Kriechen, angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Methode bietet eine quantitative Möglichkeit, wichtige Embryo-Verhalten während der Entwicklung zu analysieren, wie peristaltische Muskelkontraktionswellen, einschließlich Wellenperiodizität, Amplitude und Muster, sowie Wellenwirkung auf Embryo-Rollen und Haltung. Dies kann bei Analysen verschiedener Mutanten nützlich sein, um die Rolle bestimmter Gene bei der Regulierung dieser und anderer Verhaltensweisen während der embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Wir haben Veränderungen in der muskelspezifischen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 und CONACYT 2012-037(S) an VP unterstützt.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referencias
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