果蝇胚胎肌肉收缩的实时成像和分析
Summary
在这里,我们提出一种以非侵入性和细节导向的方式记录果蝇胚胎胚胎肌肉收缩的方法。
Abstract
协调肌肉收缩是果蝇胚胎早期出现的节奏行为的一种形式。神经感官反馈电路需要控制此行为。未能产生有节奏的收缩模式可能表明神经异常。我们之前发现,蛋白质O-mannosylation的缺陷,一种翻译后蛋白质修饰,影响感觉神经元的斧头形态,并导致胚胎异常协调肌肉收缩。在这里,我们提出了一个相对简单的方法来记录和分析蠕动肌肉收缩的模式,通过活成像的晚期胚胎到孵化点,我们用它来描述蛋白质的肌肉收缩表型O-mannosyl转移酶突变体。从这些记录获得的数据可用于分析肌肉收缩波,包括频率、传播方向和不同身体段肌肉收缩的相对振幅。我们还检查了身体姿势,并利用在肌肉中专门表达的荧光标记,以准确确定胚胎中线的位置。类似的方法也可以用来研究发育过程中的各种其他行为,如胚胎滚动和孵化。
Introduction
蠕动性肌肉收缩是一种有节奏的运动行为,类似于人类行走和游泳1,2,3。在果蝇晚期胚胎中看到的胚胎肌肉收缩就是这种行为的一个例子。果蝇是研究各种发育过程的优秀模型生物体,因为果蝇的胚胎发育特征良好,相对较短,易于监测。我们的方法的总体目标是仔细记录和分析胚胎肌肉收缩和放松的波浪状模式。我们使用一种简单、非侵入性的方法,提供肌肉收缩的详细可视化、记录和分析。这种方法还可用于研究其他体内过程,如在孵化前在晚期胚胎中看到的胚胎滚动。在以前的研究中,胚胎肌肉收缩主要根据频率和方向1、2进行分析。为了估计收缩的相对程度,因为它们沿着身体轴在前或后方向前进,我们使用了在肌肉中专门表达GFP的胚胎。这一分析提供了一个更定量的方法来分析肌肉收缩,并揭示在肌肉收缩的一系列蠕动波中,胚胎的身体姿势是如何维持的。
蠕动性肌肉收缩由中央模式发生器(CPG)回路和周围神经系统(PNS)、中枢神经系统(CNS)和肌肉4、5的神经元之间的通信控制。未能产生正常的蠕动性肌肉收缩可能导致缺陷,如孵化2和异常幼虫运动6,并可能指示神经异常。肌肉收缩蠕动波的实时成像和收缩表型的详细分析可以帮助发现与影响运动有关的肌肉和神经回路的遗传缺陷相关的致病机制。我们最近使用这种方法来研究机制,导致身体姿势扭转表型的p死神O-m annosylt兰斯芬酶(POMT)突变体7。
蛋白质O-mannosylation(POM)是一种特殊的翻译后修饰,其中单体糖被添加到丝氨酸或三角氨酸残留的分泌途径蛋白8,9。POM的遗传缺陷导致先天性肌肉萎缩症(CMD)在人类10,11,12。我们用果蝇作为模型系统调查了这些疾病的致病机制。我们发现,在果蝇蛋白O-mannos转酶基因POMT1和POMT2(又名旋转腹部(rt)和扭曲(tw)中发生突变的胚胎显示身体段的位移(“旋转”),导致身体异常姿势7。有趣的是,这个缺陷与发育阶段相吻合,当时蠕动性肌肉收缩变得突出7。
由于POM突变胚胎的异常身体姿势是在肌肉和表皮已经形成,并且协调肌肉收缩的蠕动波已经开始时产生的,我们假设异常的身体姿势可能是异常肌肉的结果收缩,而不是肌肉或/和表皮形态的缺陷7。CMD可能与异常肌肉收缩和姿势缺陷13相关,因此,在果蝇POMT突变体中,对姿势表型的分析可以阐明与肌肉萎缩症相关的病理机制.为了研究果蝇POMT突变体的身体姿势表型与肌肉收缩蠕动波的可能异常之间的关系,我们决定使用活的成像方法。
我们对果蝇胚胎的蠕动收缩波的分析揭示了两种截然不同的收缩模式,被指定为1型和2型波。类型 1 波是从前波传播到后波的简单波,反之亦然。类型 2 波是在前端启动的双相波,在后方方向半传播,暂时停止,形成暂时静态收缩,然后,在第二阶段,被传播的蠕动收缩所席卷从后端向前。野生型胚胎通常产生一系列收缩,包括大约75%的1型和25%的2型2波。相反,POMT突变胚胎以大约相等的相对频率产生1型和2型波。
我们的方法可以提供详细的信息,定量分析肌肉收缩和胚胎滚动7。这种方法也可以用于分析涉及肌肉收缩的其他行为,如孵化和爬行。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法为分析发育过程中的重要胚胎行为提供了定量方法,如蠕动性肌肉收缩波,包括波周期、振幅和模式,以及波效应对胚胎滚动和姿势的影响。这在分析不同突变体时非常有用,可以研究特定基因在胚胎发育过程中调节这些和其他行为的作用。我们使用肌肉特异性GFP标记强度的变化来分析肌肉收缩幅度、频率和胚胎收缩波传播的方向。GFP 信号的这些变化反映了收缩的程度,因为收缩体段将更多的 GFP…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目部分得到国家卫生研究院批准RO1 NS099409、NS075534和CONACYT 2012-037(S)副总裁的支持。
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
Referencias
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