안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별
Summary
티로신 질산 단백질의 프로테오믹 프로파일링은 3-니트로티로신 변형의 낮은 풍부성으로 인해 도전적인 기술이었습니다. 여기에서 우리는 모델로 안지오텐신 II를 사용하여 니트로 펩티드 농축 및 프로파일링에 대한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 다른 시험관 내 또는 생체 내 시스템에 대해 확장될 수 있다.
Abstract
단백질 질산은 티로신 잔기에서 가장 중요한 번역 후 수정 (PTM) 중 하나이며 진핵 세포에서 반응성 산소 종 (ROS) 및 반응성 질소 종 (RNS)의 화학적 행동에 의해 유도 될 수 있습니다. 단백질에 질산 부위의 정확한 식별은 염증, 노화 및 암과 같은 단백질 질산과 관련된 생리적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 질화 된 단백질은 유도 된 조건하에서도 세포에서 풍부하지 않으므로 단백질 질산 부위의 프로파일링 및 식별을위한 보편적이고 효율적인 방법이 개발되지 않았습니다. 여기에서 우리는 화학 환원 반응 및 비오틴 라벨링을 사용하여 니트로펩티드 농축을 위한 프로토콜을 설명하고, 그 다음에 고분해능 질량 분광법을 기술합니다. 우리의 방법에서, 니트로 펩티드 유도체는 높은 정확도로 식별 될 수있다. 우리의 방법은 이전에 보고 된 방법에 비해 두 가지 장점을 나타낸다. 첫째, 디메틸 라벨링은 니트로펩타이드의 1차 아민을 차단하는 데 사용되며, 이는 정량적 결과를 생성하는 데 사용될 수 있다. 둘째, NHS-비오틴 시약을 함유하는 이황화 결합이 농축에 사용되며, 이는 질량 분석기상 검출 신호를 향상시키기 위해 더욱 감소되고 알킬화될 수 있다. 이 프로토콜은 현재 논문에서 펩티드 안지오텐신 II 모델에 성공적으로 적용되었다.
Introduction
단백질에 티로신 잔기의 질화 형성 3-니트로티로신 많은 생물학적 과정을 조절. 티로신과 3-니트로티로신 사이의 다른 화학적 특성으로 인해, 질산 단백질은 신호작용 활성 1,2를교란시킬 수 있다. 따라서 단백질에서 적화 부위를 효율적으로 풍부하게 하고 식별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 3-니트로티로신은 인산화 및 아세틸화와 같은 다른 형태의 PTM에 비해 단백질에 대한 풍부도가 낮기 때문에 세포주 또는 조직 샘플에서 직접 내인성 질산 부위를 식별하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 니트로펩타이드의 단편화 패턴을 특성화하기 위해 질량 분석법(MS)을 사용하는 방법론(예: Zhan& Desiderio 3)이 개발되어 새로운 질소 변종 방법의 토대를 마련합니다.
현재, MS에 이어 농축 단계는 니트로 펩티드 프로파일링4,5에대한 가장 강력한 전략이다. 보강 방법은 두 클래스로 분류할 수 있습니다. 한 클래스는 3-니트로티로신을 구체적으로 인식할 수 있는 항체를 기반으로 하는 반면, 다른 클래스는 아민 군4,5로니트로기를 감소시키는 화학적 유도체에 기초한다. 항체 계법의 경우, 니트로티로신 친화열은 농축에 사용되며, 이로부터 용출된 물질이 고분해능 MS6,7에의해 더욱 해결되고 분석된다. 화학 적 유도 기반 방법의 경우, 펩티드 또는 리신의 N 말단에서 아민 그룹은 아세틸화, 상대 및 절대 정량에 대한 등화 태그 (iTRAQ) 또는 탠덤 질량 태그 (TMT) 시약에 의해 첫 번째 단계에서 차단되어야한다. 다음으로, 감속기는 바이오틴 결찰, 설피드릴 펩타이드 변환 또는 다른 유형의 태깅 시스템을 포함하는 새로 형성된 아민 그룹을 수정한 후 아미노티로신으로 니트로티로신을 감소시키기 위해 사용된다8,9, 10,11. 지금까지 확립된 대부분의 프로토콜은 내인성 질화 단백질 대신 체외 에서 과질화 된 단백질을 기반으로합니다.
본 연구에서, 니트로티로신의 화학적 유도의 변형된 절차는 니트로펩타이드 농축 및 식별을 위해 개발되었으며, 이는 MS 검출 동안 향상된 감도를 나타내고 정량화 목적으로 적합하다. 생물학적 시스템에서 이 방법을 채택한 당사의 최근 연구는 골수성 유래 억제세포(MDSCs)에서 생성된 RNS에 의한 Tyr394에서 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK)의 질질이 종양 미세환경의 면역억제(12). 따라서, 니트로펩티드 식별의 우리의 방법은 복잡한 생물학적 샘플에도 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 단편화 패턴이 알려져 있고 니트로프로테오믹 연구에서 널리 사용되는 모델 펩티드 안지오텐신II를 사용하여 우리의 프로토콜을 설명한다 8,9,10,11,일례로.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 프로토콜은 니트로펩티드 농축 및 프로파일링을 설명합니다. 안지오텐신 II를 모델 펩타이드로 사용하여 그림 1에표시된 절차를 설명했습니다. 니트로-안지오텐신 II를 얻은 후, 펩티드의 1차 아민은 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계 중 하나인 추가적인 아민 컨쥬게이션을 피하기 위해 차단되어야 한다. 현재 프로토콜에서, 디메틸 라벨링은 두 가지 이유로 1차 아민…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 암 학회 기관 연구 보조금 IRG-14-195-01에 의해 지원되었다 (M. 샤론 스택은 주요 조사자입니다; X.L.은 하위 수급자입니다). 이 간행물은 그랜트 번호 KL2 TR002530 및 UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI)의 국립 보건원, 국립 번역 과학 발전 센터, 임상 및 번역 과학 상에서 부분적인 지원으로 가능하게 되었습니다. X. L. 인디애나 CTSI KL2 젊은 구도자 상 수상자입니다. S. F.는 월터 암 재단이 기본 암 보조금을 진행하는 것을 지원하고 있습니다. X. W. 중국 일반 프로그램의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 됩니다 (그랜트 번호 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
Referencias
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