Дизайн Цекал Лигация и прокол и интраназальные инфекции Двойная модель сепсиса индуцированной иммуносупрессии

Сепсис инициирует сложное взаимодействие провоспалительных и противовоспалительных процессов ихарактеризуется гипервоспалительным ответом и последующей иммунной дисфункцией 1,². Сепсис представляет собой глобальный приоритет в области здравоохранения и вызывает большое число смертей в отделениях интенсивной терапии (IcUs)³. Заболеваемость сепсисом, по оценкам, превышает 30 миллионов случаев заболевания во всем мире в год, при этом смертность превышает 30%, несмотря на успехи в управлении СИС^4,5. В 2017 году Всемирная организация здравоохранения приняла резолюцию по совершенствованиюпрофилактики, диагностики и лечения этого смертельного заболевания 5. Тем не менее, недавние исследования показали, что смерть не является результатом первичной инфекции у тяжелых пациентов септика, а скорее от вторичной нозокомиальной инфекции (особенно пневмонии), вызванной иммуносупрессией^6,7 . Поэтому срочно необходимо понять механизмы, почему у больных септом развивается вторичная инфекция, и открывать более эффективные методы лечения. Здесь описана двойная модель, также известная как модель с двойным ударом, для изучения иммуносупрессивного явления, происходящего у пациентов с затяжным сепсисом.

В качестве экспериментальной модели золотого стандарта в исследованиях полимикробного сепсиса, цекаляющей перевязки и прокола (CLP) является операция характеризуется перевязкой цекум и перфорации, которая способствует полимикробный перитонит и сепсис^8,9 . Патофизиологический процесс и цитокин профили, наряду с кинетикой и величины, похожи на клинический сепсис. Положение перевязки, размер иглы, используемый для прокола, и количество чекал проколы являются основными факторами, которые влияют на смертность после CLP.

Нозокомиальная пневмония является основной причиной смертности среди тяжелобольных пациентов с сепсисом. Основным типом организмов, вызывающих тяжелый сепсис, являются золотистый стафилококк (20,5%), виды Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (в основном кишечная палочка,16,0%), и грибы (19%). Между тем, последние исследования показали, увеличение заболеваемости грамположительных организмов, которые в настоящее время почти так же распространены, как грамотрицательные инфекции³.

Метод, описанный в этом протоколе включает CLP, выполняется в качестве "первого удара", чтобы вызвать субсмертельный полимикробный перитонит, который проявляется состояние иммуносупрессии. Процедура также включает в себя последующее интраназальное заготворение S. aureus в качестве "второго удара", чтобы обеспечить клинически соответствующую исследовательскую платформу.

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Университетом Северной Дакоты институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Цекалья и прокол

ПРИМЕЧАНИЕ: самки C57BL/6 мышей (вес, 18-22 г; возраст, 6-8 недель) случайным образом делятся на шесть групп: контрольная группа (Ctrl), инфекционная группа (SA для S. aureus),две фиктивные группы и две группы CLP. Ctrl животных остаются без хирургического вмешательства и вторичных инфекций травм. SA животных подвергаются S. золотистых легких инфекции без операции. Шам-управляемые животные проходят ту же лапаротомию с экспозицией цекума (кроме цекума, не лигативого, ни проколотого). Восемь мышей в группе используются для анализа выживаемости, и от трех до пяти мышей используются для оценки воспаления в различные точки времени.

1. Перед операцией стерилизовать все хирургические инструменты и материалы путем автоматического вскрытия в течение 20 мин. Очистите и дезинфицируют операционный стол дезинфицирующими салфетками. Чтобы установить стерильные условия во время операции, покройте все оперативные поля надлежащими стерильными хирургическими шторами, и носите крышку для волос, хирургическую маску, защитные очки, хирургическое платье и стерильные перчатки.
2. Взвешивание и обезболание мыши с помощью 0,1 мл / мышь кетамина (80 мг/кг), ксилазин (10 мг/кг) смесь интраперитоне. С большим и указательным пальцами левой руки формирования U-образного положения, подход шеи мыши из-за гладко и осторожно, а затем держать шею сразу за ушами, так что мышь голова очень сдержан. Используйте мизинец, чтобы держать правую заднюю ногу мыши и использовать средние и безымянные пальцы (все пальцы левой руки), чтобы держать тело.
3. Проверьте интенсивность анестезии по ноге щепотку до без сгибания конечностей.
4. Бритье нижних квадрантов живота с помощью электрической бритвы и дезинфицировать область с йодом.
5. Поместите мышь на стерильную поверхность в положении на спине, при этом голова ориентирована от оператора. Drape мыши с стерильным полотенцем с отверстием над запланированным хирургическим разрезом для поддержания стерильных полей.
6. Сделайте продольной разрез кожи (около 0,5 см в длину) скальпелем в левой нижней части живота. Используйте небольшие ножницы для расширения разреза (1-2 см).
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проникнуть в полость перитонеальной полости.
7. Сделайте внутримышечный разрез, чтобы получить доступ в полость перитонеальной полости и позволяют воздействие cecum с прилегающей кишки.
8. Изолировать цекум на левой стороне живота (в большинстве случаев это делается с помощью тупых анатомических щипцы) и удалить его на стерильной драпировки, оставляя тонкой и толстой кишки в брюшной полости.
   ВНИМАНИЕ: Избегайте повреждения паевтерных кровеносных сосудов.
9. Ligate cecum на дистальной позиции 25%, чтобы создать длительную инфекцию с относительно низкой смертностью.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы не ligate илеоцекального клапана.
10. Перфорат cecum с 21 G 1 1 /2 иглы путем одного через и через прокол (два отверстия) на полпути между перевязкой и кончиком cecum в наименее васкуляризированной области.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы не проколоть кровеносные сосуды.
11. Снимите иглу. Аккуратно выдавливать небольшое количество кала из отверстий проникновения, чтобы обеспечить полную толщину перфорации.
    ВНИМАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы не препятствовать непрерывности кишечника во время процедуры.
12. Замените цекум в брюшную полость.
13. Закройте живот двумя слоями с 4-0 нейлоновых хирургических швов. Закройте мускулатуру брюшной полости, применяя простые бегущие швы и закройте кожу, применяя простые прерванные швы. Очистите кожу с помощью йода.
14. Введите 1 мл претеплового (37 градусов по Цельсию) 0,9% стерильного нормального сочного раствора (NS) на задней подкожной, чтобы заменить третью потерю пространства и поместить его на теплую площадку для восстановления.
15. Вернуть мышей в клетку в комнате, контролируемой температурой (22 градуса По Цельсию) с 12 ч светлых/темных циклов и свободным доступом к пище и воде. Мониторинг мышей каждые 0,5 часа, по крайней мере 2 ч, то каждые 6 ч, по крайней мере 2 г, то каждые 12 ч в течение 3 дней, или эвтаназии их, когда умирающий для анализа выживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До- и послеоперационная анальгезия (бупренорфин, 50 мкг/кг субкожно каждые 12 ч) рекомендуется в течение 24 ч до операции до 48 ч после операции^9,10.

2. Вторичная легочная инфекция с S. aureus

ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением ctrl и SA групп, выживших мышей в 3 дня после CLP в фиктивных и CLP групп ы должны быть введены интраназно с 30 Зл бактериальной подвески или NS, соответственно. Выживших мышей в группе SA следует прививать интраназно с бактериальной суспензией.

1. Обезболилизировать мышь путем интраперитонового введения 100 л раствор кетамина (45 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) и ждать, пока мышь дышит медленно. Угол прокола между иглой и брюшной стенкой составляет менее 30 градусов для медленной инъекции.
2. С помощью микропайпета, медленно и интраназа, привить с 30 Зл 1 х 10⁷ колонии формирования единицы (CFU) S. aureus, чтобы быть аспирированных на вдыхание. Держа мышь за уши в вертикальном положении, медленно опускают 2-3 л бактериальной подвески в обе ноздри каждый раз. Отрегулируйте скорость выпуска, чтобы позволить мыши вдыхать, не образуя пузырьки и упадая.
3. Поднимите мышь вверх и вниз, с головой вверх и хвост вниз, чтобы помочь бактериям войти в трахею. Переместите мышь вверх быстро и сильно, двигая ее вниз мягко и медленно, чтобы увеличить гравитацию. Повторите зависание около 15x, пока все бактерии вдыхают, что должно занять 10-15 минут для каждой мыши.
4. Положите мышь на спину и голову на угловые постельные принадлежности (около 35 ") и смотреть на мышь, пока его дыхание возвращается в нормальное русло, и он полностью оправился от анестезии и процедур.
5. Поместите мышь обратно в клетку в комнате, контролируемой температурой (22 градуса По Цельсию) с 12 ч светлых/темных циклов и неограниченным доступом к пище и воде.
6. Проверьте условия мыши каждые 2 ч в течение первого дня и каждые 12 ч после этого в течение 4 дней после операции. Эвтаназии их, когда умирающий для анализа выживаемости или 24 ч после инфекции для оценки воспаления.

3. Анализ параметров

1. Выживание мышей
   1. Мониторинг мышей в течение 7 дней. Euthanize, когда умирающий и генерировать кривые выживания с помощью методов Каплан-Мейер¹¹.
2. Бактериальные подсчеты
   1. 24 ч после инъекции SA, урожай крови, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (BALF), и перитонеальной жидкости для промывки (PLF) от мышей. Впоследствии, добавить 100 л разбавитель в питательные агар пластины и культуры их на 37 кв кС на 24 ч, чтобы определить бактериальной колонии насчитывает^11,12,13.
3. Цитокинов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Провоспалительные концентрации цитокинов IL-1, IL-6 и TNF в сыворотке и BALF у мышей должны оцениваться с использованием комплектов ELISA в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Пальто 96 хорошо ELISA пластины с 100 Л / хорошо различных захвата антитела рабочего решения для запуска стандартов в дубликат и образцы в тройной. Запечатать тарелку и оставить его на ночь при 4 градусах Цельсия.
   2. Вымойте тарелку три раза с 255 Л/ л / хорошо мыть буфер (1x PBS, 0,05% Tween-20).
   3. Чтобы заблокировать неспецифическую привязку, добавьте 200 л/ну разбавитель. Печать пластины и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
   4. Подготовка стандартного решения: Восемь двухкратных серийных разбавлений от 1000 пг/мл.
   5. Добавьте 100 л/колодец стандартов или образцов к соответствующим скважинам и 100 л/колодец к пустым скважинам. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 2 ч или на ночь при 4 градусах Цельсия.
   6. Вымойте тарелку 5x с 255 Л/ Л / хорошо мыть буфер.
   7. Добавьте 100 Л/хорошо различных рабочих растворов для обнаружения антител к соответствующим скважинам. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 1 ч.
   8. Вымойте тарелку 5x с 255 Л/ Л / хорошо мыть буфер.
   9. Добавьте 100 л/колодец разбавленного раствора HRP ко всем скважинам. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 30 минут.
   10. Вымойте тарелку 5x с 255 Л/ Л / хорошо мыть буфер.
   11. Добавьте 100 Л/хорошо разбавленный раствор TMB. Инкубировать тарелку от света на RT в течение 15 минут.
   12. Добавить 50 Л / хорошо стоп-раствор (1 M H₃PO₄). Читайте абсорбцию на 450 нм с помощью считывателя пластин.
4. Цитометрия потока
   1. Получить общее количество ячеек от BALF. Лиза эритроцитов с помощью aCK lysing буфера и мыть 2x с помощью PBS.
   2. Проанализируйте то одноклеточные суспензии по цитометрии потока, как ранее описано¹¹. Для окрашивания поверхности, пятно в нейтрофилах (CD11b'GR-1) с антителами APC anti-mouse CD11b и антителами против мыши Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C). Соберите минимум 3 х 10⁴ живых, не-мусорных клеток для анализа.

В зависимости от экспериментального проектирования и процедур, C57BL/6 мышей были подвергнуты CLP, и через 3 дня, они были введены бактерии интраназалически (Рисунок 1). Как показано на рисунке 2, мыши начали умирать при 12 ч после индукции перитонита. Две мыши из группы CLP-SA и три мыши из группы CLP-NS умерли до интраназального s. aureus зависания. Смертность не была обнаружена у неинфицированных мышей, не работающих под или фиктивным управлением. Поэтому, когда мыши были CLP до пневмонии, смертность была гораздо выше (p qlt; 0.05). После того, как интраназальные бактерии бросают вызов (1 x 10⁷ CFU), три из восьми мышей выжили в группах SA и Sham-SA, а четыре из восьми мышей выжили в группе CLP-NS. Тем не менее, все восемь мышей умерли в группе CLP-SA. В отличие от этого, каждая мышь в группе Ctrl и группе ШамзНС выжили. CLP мышей показали больше смертности, когда впоследствии оспаривается с S. aureus. Смертность S. aureus после CLP (100%) выше, чем инфицированы в одиночку (37,5%) или S. aureus после фиктивных (37,5%; стр. 0,05).

Как показано на рисунке 3, тяжелый некроз цекума наблюдался у животных после CLP, но в большей степени от двойной хит группы (CLP-SA). Тем не менее, не было валового изменения cecum в контроле или одного удара с бактериями групп. Кровь, BALF, и PLF были культивированы для оценки легких бактериального зазора мышей, инфицированных S. aureus 3 дней после CLP. Эта высокая летальность была связана со значительно увеличенным S. aureus CFU в крови и PLF мышей CLP по сравнению с фиктивными мышами (p qlt; 0.05; Рисунок 4A,C). Количество S. aureus CFU в крови и BALF мышей CLP-SA было заметно больше, чем у мышей CLP-NS (p slt; 0.01; Рисунок 4A,B).

Для провоспалительных цитокинов, результаты показали, что уровень экспрессии сыворотки IL-1 , IL-6, и TNF значительно увеличилось на 24 ч после бактериального зависания у выживших сепсиса мышей по сравнению с мышами, которые прошли CLP в одиночку или в фиктивных мышей оспаривается с S. aureus (Рисунок 5A). Тем не менее, провоспалительные цитокины немного увеличились в BALF септических мышей со вторичной инфекцией, отличается от тех, в контроль инфицированных мышей (SA мышей) и ШамзСА. В то же время, дважды поразив мышей выставлены значительно снизились уровни в BALF IL-1 , IL-6, и TNF' уровнях по сравнению с sA и Sham sA мышей (p lt; 0.001; Рисунок 5B).

Как показано на рисунке 6, мышей были принесены в жертву на 24 ч после инфекции, и относительный процент нейтрофилов в BALF были обнаружены цитометрии потока. Дважды хит мышей выставлены значительное сокращение нейтрофилов в BALF по сравнению с мышами, которые прошли S. aureus пневмонии в одиночку. В совокупности эти данные показали, что CLP ухудшает иммунные реакции хозяина, что приводит к повышенной восприимчивости к вторичной бактериальной пневмонии.

Рисунок 1 : Экспериментальный дизайн. Мыши были случайным образом разделены на шесть групп. Две группы подверглись эквалированию и проколу (CLP) в D0, а остальные были фиктивными или не эксплуатирулись. Через три дня после операции (D3), S. aureus (SA, 1 x 10⁷ колоний, образующих единицы (CFU) или нормальный солен (NS) вводили интраназно. Контрольная группа (Ctrl) мышей не были интраназанически привиты. Кровь, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (BALF), и перитонеальной жидкости лаважа (PLF) были собраны 24 ч после инъекции SA для анализа количества бактерий. Коэффициент смертности в каждой группе наблюдался в течение 7 дней для анализа выживаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Выживание мыши. C57BL/6 мышей, представленных либо CLP или фиктивной хирургии получил S. золотистый (SA) или нормальный солин (NS) на третий день после операции (n 8 мышей на группу). Мыши были проверены в течение 7 дней, и смертность была зарегистрирована каждые 12 ч. Каплан-Мейер кривых выживания, журнал ранга тест (Зп злт; 0,05) по сравнению с ШамзСА мышей и SA мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Мышь cecum. Вторичная инфекция была индуцирована 3 дня после CLP. 24 ч после инфекции SA, мышей были принесены в жертву, чтобы собрать ткани толстой кишки. Представлены репрезентативные фотографии цекалной перегазации под различными травмами. SA s S. aureus; NS - нормальный солин; CLP - цекалная лигация и прокол. Шкала бар No 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4 : Бактериальные подсчеты и репрезентативные изображения агарных пластин. Через 3 дня после операции мышам интраназатически привили 1 x 10⁷ CFU S. aureus (SA) (n 3 мышей на группу). Кровь, BALF, и PLF были собраны 24 ч после инъекции SA, и бактериальные колеи колонии были определены после 24 ч инкубации. Результаты выражаются в виде средней - SEM. Односторонней ANOVA (пост-специальный Tukey; qp lt; 0,05; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5 : ELISA обнаружения секреции цитокинов. Вторичная инфекция была индуцирована 3 дня после CLP. Концентрации IL-1, IL-6 и TNF в сыворотке крови (A) и BALF (B ) от мышей после инфекции SA (n - 3 мышей на группу). Данные представлены в качестве среднего SEM трех экспериментов. Односторонний ANOVA (пост-специальный Tukey; злэт; 0,05; злите; 0,01; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6 : Репрезентативная частота проникновения нейтрофилов. 24 ч после интраназалальной инфекции, мышей были принесены в жертву, чтобы получить BALF (n No 3 мышей на группу). Процент нейтрофилов (CD11b, GR-1⁾был количественно цитометрии потока и показаны в качестве средств SEM из трех экспериментов. Односторонний ANOVA (пост-специальный Tukey's; «p»lt; 0.0001; ns s s не значительно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

В качестве золотой стандартной модели для исследования сепсиса, CLP имеет сочетание трех оскорблений, в том числе травмы тканей, вызванные лапаротомией, некрозом из-за перевязки цекума и инфекции в результате утечки микробов, которая вызывает перитонит с транслокацией бактерий в кровь⁸. Таким образом, CLP имитирует сложность человеческого сепсиса лучше, чем многие другие модели. Тем не менее, основным ограничением текущей модели CLP является неспособность отразить более длительную фазу сепсиса видели у пациентов в ОИТ^3,4,5. Таким образом, клинически релевантная двойная модель (двойная модель) была предложена для отражения задержки смертности от сепсиса и изучения механизмов, лежащих в основе легочной вторичной инфекции. В этом протоколе, сепсис был индуцирован путем объединения CLP с S. золотистым легочной инфекцией в 3 дня после CLP. Двухпораженные мыши продемонстрировали более высокую смертность, серьезные повреждения цекумов, ослабленную кровь, зазоры бактерий BALF, более низкие провоспалительные цитокины и более низкие нейтрофилы в BALF. Это привело к тяжелому сепсису, который имитирует состояние иммуносупрессии в клиниках.

Следующие описания являются критическими шагами. Показано в деталях, как производить сублетальный сепсис в тех же условиях. Во-первых, самки мышей были использованы, потому что самки мышей более устойчивы к CLP, чем мышей мужского пола¹¹. Во-вторых, clP-индуцированной смертности зависит от нескольких технических параметров, таких как длина cecum ligated, размер иглы, и количество cecal проколы⁹. Лигация примерно 75% цекума вызывает тяжелый сепсис, перевязка 60% цекума индуцирует сепсис среднего уровня, а перевязка 25% или менее цекума приводит к незначительному сепсису^9. Он был выбран для стандартизации модели, выполняя мягкий CLP (25%, один через и через прокол с 21 G 1 1 / 2 иглы), чтобы вызвать сублетальный сепсис^11,12. В-третьих, жидкости реанимации рекомендуется для предотвращения шока и быстрой смерти из-за коллапса циркуляции и разработать гипердинамический сепсис модели животных, которая более тесно имитирует гемодинамический профиль человеческого сепсиса¹³. Кроме того, использование анальгетиков, таких как бупренорфин, следует рассматривать с экспериментальной и этической точки зрения¹⁰.

Три дня после CLP был выбран в качестве временной точки, чтобы вызвать вторичную инфекцию, чтобы отразить иммуносупрессивную фазу сепсиса. Большинство пациентов с сепсисом имеют длительный курс больницы с большинством смертей, происходящих за 3 дня, и многие затем войти в вторичную больничную пневмонию, которая была последовательно показана в недавнем исследовании с CLP вместе с P. aeruginosa¹⁴ . Предыдущие результаты других лабораторий также показывают, что через 3 дня после CLP, мыши показывают высокую чувствительность к вторичным привитых бактерий, и через день после инфекции был поворотным моментом от чрезмерного воспаления к иммуносупрессии^{15, 16}.

Кроме того, различия в штаммах бактерий и дозировке привили являются значительными факторами, вызывающими изменчивость в двойной модели. Выбор штамма и дозы основан на потребностях экспериментального проектирования вторичной инфекции во время иммуносупрессивного состояния. На основе предыдущих выводов, 1 х 10⁷ CFU S. aureus был выбран для этого исследования.

Для повышения эффективности интраназального бактериального рода непосредственно в легкие мыши, внимание должно быть уделено объему зависания, времени и положению тела. Есть и другие оперативные вопросы, которые могут чрезвычайно повлиять на исход эксперимента. К ним относятся проведение мыши вертикально, ввод яровые бактерии с несколькими низкими дозами жидкости в обе ноздри отдельно во время каждого закрепления, наблюдая за вдыханием жидкости без формирования пузырьков, контролируя скорость вдыхания; перемещение мыши вверх быстро, то вниз медленно, и укладка мыши под углом 45 ", чтобы оправиться от зависания. Администрация интраназаловых бактерий является неинвазивной и помогает предотвратить удушье, повысить доступность, повысить безопасность и свести к минимуму хирургические травмы.

Однако этот метод имеет свои ограничения. Поскольку это методическое исследование, данные об изменениях клинических признаков не обсуждались; противовоспалительные цитокины; и количество и функции моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в крови. Лабораторные мыши часто инбредные, имеют одинаковые возрасты и веса, размещаются в конкретных патогенных средств, и, как правило, не имеют сопутствующих состояний, таких как уже существующие иммуносупрессии. Тем не менее, различные пол, возраст, иммунный и питательный статус, а также возможное адъювантное лечение, такое как антибиотики пациентов, могут привести к неоднородным клиническим исходам. Учитывая неоднородность пациентов, такие переменные, как возраст, вес, уже существующие заболевания и клиническая поддерживающая помощь, должны быть тщательно пролечены.

Разработка этой двойной модели (двойной хит модели) является своевременным и важным для инфекции и иммунитета научно-исследовательского сообщества, поскольку она напоминает прогрессирование от гипер-до гипо-воспалительной фазы человеческого сепсиса. Он более точно отражает общий клинический сценарий вторичной нозокомиальной пневмонии у пациентов с сепсисом. Эта модель может помочь разработать новые терапевтические стратегии для сепсиса индуцированной иммуносупрессии.