Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

A ubiquitinação é uma das modificações pós-translacionais mais conservadas e é fundamental para uma grande variedade de organismos, incluindo leveduras, plantas e vertebrados. A ubiquitinação consiste na fixação covalente da ubiquitina, um polipeptídeo de aminoácido 76 altamente conservado, para direcionar proteínas e ocorre em três etapas sequenciais envolvendo três enzimas, ou seja, E1-ativando, E2-conjugating e E3 ligase^{1, 2,3}. Esta modificação pós-translacional desempenha papéis centrais em um amplo espectro de processos biológicos. De fato, as ligases da E3, que proporcionam a especificidade da reação, constituem uma grande superfamília de enzimas e são as enzimas mais abundantes do sistema de ubiquitina^4,5,6. Os efeitos a jusante do ubiquitinação da proteína dependem da natureza da modificação: monoubiquitination, multimonoubiquitination, e polyubiquitination linear ou ramificado. O monoubiquitination é associado raramente com a degradação degradação, mas preferivelmente esta modificação é envolvida em mediar vários eventos de sinalização. A poliubiquitinação envolve o N-terminal ou os resíduos de lisina na própria molécula de ubiquitina, e o destino de uma proteína policuquitinada depende de qual resíduo está envolvido na extensão da cadeia de ubiquitina. Há muito se sabe que a poliubiquitinação mediada pela lisina 48 de ubiquitina induz a degradação degradação. Pelo contrário, a poliubiquitinação via lisina 63 da ubiquitina é frequentemente associada à ativação proteica^7,8,9. Semelhante a outras importantes modificações pós-translacionais, a ubiquitinação é reversível e a remoção de ubiquitina de proteínas é assegurada por proteases específicas denominadas deubiquitinases (DUBs), que surgiram como importantes reguladores dos processos celulares ^{2. º , 10}. importante, muitos dubs são altamente especializados, e regulam, através deubiquitinação, substratos específicos, indicando que um equilíbrio fino entre ubiquitinação e deubiquitinação é crítico para a função protéica. E3s e dubs, junto com a maquinaria da degradação do Proteassoma e os fatores acessórios, formam o sistema do Proteassoma de ubiquitin (UPS, com > 1200 genes) que regula as vias de sinalização principais, diversas de que são associadas com o crescimento e a proliferação da pilha, determinação de destino celular, diferenciação, migração celular e morte celular. É importante ressaltar que a desregulação de várias cascatas de sinalização envolvendo a ubiquitinação promove atumorigênese e as doenças neurodegeneradas^5,11,12,13, a ¹⁴.

A ubiquitinação desempenha papéis penetrantes na biologia da cromatinae nos processos dependentes de DNA^15,16,17. Por exemplo, a monoubiquitinação da histona H2A em lisina 119 (doravante H2A K119ub) é uma modificação crítica pós-translacional envolvida na repressão transcricional e no reparo do DNA^{18,19,20, 21,22}. H2A K119ub é catalisada pelo complexo repressivo Polycomb 1 (PRC1), que desempenha um papel fundamental na manutenção da informação epigenética e é altamente conservado da Drosophila para o ser humano. O PRC1 canônico é constituído, notavelmente, pelos RING1B e BMI1, que são o núcleo do complexo de ligase da ubiquitina E3, responsável pelo evento de ubiquitinação^22,23. Na Drosophila, a monoubiquitinação H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub em mammalianos) é revertida pelo Dub Calypso, que interage com o adicional sexo Comb (ASX) formando o polycomb-REPRESSIVE Dub (PR-Dub) complexo²⁴. O ortólogo de mamíferos de Calypso, BAP1, é um supressor de tumor suprimido ou inativado em várias malignidades^{humanas 25,26,27,28, 29. º , 30} anos de ^{, 31 de dezembro , 32 , 33}. BAP1 regula os processos dependentes de DNA no núcleo e apoptose mediada por sinalização de cálcio no retículo endoplasmático^{33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42}. BAP1 monta complexos proteicos multisubunitários contendo reguladores de transcrição notavelmente ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (asxls), três ortologues de ASX^38,43. Asxls use o domínio do adaptador deubiquitinase (deubad), também denominado domínio asxm, para estimular BAP1 atividade Dub^35,36,44. Assim, ASXLs desempenham papéis importantes na coordenação da atividade BAP1 DUB na cromatina e, mais amplamente, sua função supressor tumoral.

Existem vários métodos para estudar os processos de ubiquitinação e deubiquitinação. Notavelmente, os ensaios bioquímicos usando proteínas purificadas de bactérias permanecem muito poderosos na demonstração de ubiquitinação direta ou remoção de ubiquitina de substratos específicos. Esses experimentos podem ser conduzidos para investigar uma série de parâmetros como determinar a exigência de complexos mínimos, determinar a cinética de reações, definir relações estrutura/função e compreender o impacto da patologia patológica mutações genéticas. Aqui, nós fornecemos protocolos para realizar reações de ubiquitinação e deubiquitinação em substratos de cromatina com componentes purificados. Como um sistema modelo, o ubiquitinação in vitro e o deubiquitination da proteína H2A o são apresentados. As proteínas bactérias-purificadas montadas em complexos mínimos de RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD são usadas para ubiquitinação ou deubiquitinação de H2A nucleossomal, respectivamente.