예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

동물 실험 동물 실험 지구의 남쪽 핀란드 (ESAVI/6285/04.10.07/2014)의 위원회에 의해 승인 되었다. 1입니다. BBTB 모방의 설립 참고: 세포 배양 매체와 보충 자료의 테이블에 자세히 나와 있습니다. 이다의 준비참고: 다음 볼륨은 10 cm 배양 접시 또는 T75 셀 문화 술병에 적합 합니다. 살 균 세포 문화 후드 신중 하 게 씻는 다 5 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 교양된 이다. 부드럽게 진공 펌프를 사용 하 여 PBS를 삭제 하 고 셀 분리 시 약 5 분의 2 개 mL를 추가 (37 °C, 테이블의 자료를 참조 하십시오) 세포를 분리. 현미경 세포 분리를 확인 합니다. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 외피의 5 분을 초과 하지 마십시오. 셀 분리 시 약의 활동을 억제 하기 위해 선박에 메 마른 완전 한 사이토 세포 배양 매체 (ABM +) 10 mL를 추가 합니다. 살 균 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 살 균 15 mL 튜브에 선박에서 분리 된 세포를 전송. 3 분 250 rcf에 세포 현 탁 액을 원심 (가속: 9 rcf/s, 감속: rcf/s) 실 온 (RT)에서. 한편, 준비 ( 재료의 표참조) 삽입: 소독 집게를 사용 하 여 살 균 6 잘 플레이트 (그림 1B)의 뚜껑 위에 뇌 쪽 (그림 1A)와 삽입. 그는 접시에 배치 될 수 거꾸로 삽입 만지거나 삽입 과정에서 이동 하지 않고 미리 확인 합니다.참고: 삽입의 적절 한 배치 수 있습니다 사이토 서 스 펜 션의 함정 사이 막 우물의 바닥. Centrifuged, 일단 신중 하 게 세포 현 탁 액;에서 상쾌한 삭제 사이토 펠 릿 resuspend 1 mL에 ABM + 부드럽게 펠 릿 튜브’에 resuspending에 의해 s 최대 5 배 벽. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 세포의 과도 한 pipetting 하지 마십시오. 셀을 계산 하 고 1.5 ABM의 400 µ L 105 셀 x 셀 서 스 펜 션 밀도 조정 + 삽입. 삽입’의 뇌 쪽의 한가운데에 세포 현 탁 액 배치 s 막 (그림 1B) 하 고, 매우 신중 하 게, 살 균 피펫으로 팁 모 세관 힘을 사용 하 여 그것을 확산. 특히 허약한 막으로 직접 접촉을 하지 마십시오. 삽입의 뇌 쪽으로 여전히 최대, 삽입에 다시 6-잘 접시를 놓습니다. 그러면 세포 현 탁 액 막과 우물 (그림 1C)의 실제 바닥 사이 갇혀 있다. 그것은 멤브레인에 이다 균질 확산을 방지할 것 이다 세포 현 탁 액에 공기 방울을 피하십시오. 인큐베이터에 접시와 두뇌 측면 삽입, 배치 (37 °C 5 %CO2) (인간의 기본 이다)에 최소 2 h (murine 불멸 하 게 이다) 그리고 h 6까지 세포의 접착을 허용 하도록.참고: 삽입 거꾸로 유지, 세포 접착의 시각화 현미경 수는 없습니다. 그것은, 따라서, 별도 일반 셀 문화 배 씨는 용기에 세포 접착 시간 제어 하는 것이 좋습니다. 결과 신뢰할 수 없을 때 세포 막 손상으로 막의 신중한 조작 해야 합니다. 보육 시간의 끝에, 시드 영역 외부 세포 현 탁 액 누출의 부재를 확인 하 고 만약 그들이 새 삽입 삭제. 6 잘 플레이트 삽입 이제 혈액 쪽 (그림 1A)는 것과 일반 위치로 되돌립니다. 각 우물에 ABM + 2.6 mL를 추가 합니다. 각 삽입 완료 사이토 매체의 2.5 mL를 붓고 고 인큐베이터에 접시 (37 °C 5 %CO2). 내 피 세포의 준비참고: Murine 뇌 microvascular 내 피 세포 (bEND3)에 대 한 셀 최대 셀 연락처 실험 당일 최적의 꽉 접합 단백질 표정 트리거링 되도록 100% 합류를 도달 해야 한다. 이 이다의 존재는이 셀에 대 한 꽉 접합 단백질 표정에 필요한 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HuAR2T)에 대 한 적용 되지 않습니다. 앞에서 설명한 이다 (단계 1.1.1와 1.1.2.)에 대 한 진행 합니다. Centrifuged, 일단 신중 하 게 버리고 상쾌한; 내 피 세포 펠 릿 resuspend 천천히’튜브에 세포 현 탁 액 pipetting으로 완전 한 내 피 세포 배양 매체 (EBM +) 1 mL에 s 최대 5 배 벽. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 세포의 과도 한 pipetting 하지 마십시오. 셀의 개수와 2.5 mL에 2 x 105 셀에 셀 서 스 펜 션 밀도 조정/세럼 (EBM-)과 혈관 내 피 성장 인자 없는 내 피 세포 배양 매체의 삽입-(VEGF-A). 삽입을 포함 하는 접시 밖으로 가십시오, 신중 하 게 혈액에서 매체를 삭제 하 고 내 피 세포 현 탁 액의 2.5 mL와 함께 그것을 대체. 인큐베이터에 접시를 반환 (37 °C 5 %CO2) 하룻밤 사이에 막 내 피 세포에 대 한 그것을 두고. 다음 날, prewarmed 혈 청 무료 사이토 매체 (ABM-)의 3 mL을 각 영역 전송 하 여 살 균 6-잘 접시를 준비 합니다. 소독 집게와 삽입을 처리 하 여 신중 하 게 혈액 쪽에서 내 피 완전 한 매체를 삭제, 삽입 포함 ABM-새로운 접시에 놓고의 EBM-2.5 mL를 추가 합니다.참고: EBM-의 사용은 내 피 방 벽의 설립에 대 한 중요 한 (토론 섹션을 참고 하십시오). 인큐베이터에는 삽입을 두고 (37 °C 5 %CO2) 사이토와 함께 연결 하는 최소한의 물리적 장애 및 내 피 지하실 막의 생산을 허용, 5 일에 대 한 온도 변화 내 피 세포, 그리고 결국,는 BBTB 형성을 모방. 매체 glioma 세포 배양에 전송의 하루에 교체 (섹션 1.4 참조 하십시오). (선택 사항) BBTB 모방 투과율의 측정 삽입의 뇌 쪽으로 혈액에서 시간이 지남에 작은 분자 무게 형광 염료-fluorescein 나트륨 (Na-플로리다)의 수동 확산 다음 공식에 따라 침투성 값의 계산을 허용 한다:여기, dF잘형광 값에 특정 시간 세포 배양 매체 autofluorescence 값을 뺀 시점에서 잘 측정, dT 는 시간 (초), A 는 평방 센티미터, 그리고 에 방 벽의 표면 dF삽입 형광 값 삽입 중간 autofluorescence 값을 뺀 같은 시간 지점에서 측정). 피와 BBTB 모방의 두뇌 측면에서 매체의 100 µ L를 수집 하 고 후속 형광 측정에 대 한 별도 바닥, 블랙 96 잘 접시에 그들의 각각을 전송. autofluorescence를 해결 하기 위해 빈으로 일반 미디어를 사용 합니다. 준비 나 플로리다의 당 2.5 mL (50 µ M)에서 EBM-. 37 ° c 나 플로리다 솔루션 prewarm 삽입의 혈액에서에서 미디어를 포함 하는 미디어 나 층 시작 타이머 마자 매체 교체로 바꿉니다. 조심 스럽게 피 고 5, 30, 60, 삽입의 두뇌 측면에서 미디어의 100 µ L를 수집 하 고 120 분 검은 96 잘 접시의 우물을 각 샘플을 전송. 이 따라 양측 간의 볼륨 균형을 유지 하기 위해 삽입에서 수집 된 미디어 교체 합니다. 온도 변화를 최소화 하기 위해 각 샘플 컬렉션 간에 인큐베이터에 다시 삽입을 놓습니다. 480/560에 설정 필터 플레이트 리더를 사용 하 여 수집 된 샘플에서 형광을 계량 nm (여기 및 방출, 각각).참고: 뇌 쪽에서 형광 5 분 시간 지점에서 거의 감지 되지 않습니다. 빈에 비해 높은 값의 누출을 나타냅니다 /’삽입을 손상 s 막 또는 장벽; 따라서, 이러한 추가 분석에서 제외 합니다. BBTB에 대 한 예상된 나 플로리다 침투성 값 10-5 10-6 c m/s 범위 (표 1)에 있어야 합니다. Glioma 셀의 준비참고: 세포종 환자에서 파생 된 분야는 여기 사용 됩니다, 있지만 다음 프로토콜 부착, 상용 세포종 세포 등 U-87 밀리 그램에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. 필요한 경우, 면역 형광 이미징, 최대 4 개의 라운드 불 임 붕 coverslips 장소 (ø 0.9 cm) 폴 리-D-리 (0.01%)의 2 개 mL를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당. 30 분 동안 실 온에서 품 어. 한편, 신중 하 게 종양 분야에서에서 전송할 셀 문화 배 살 균 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 15 mL 무 균 튜브에. 종양 분야 250 rcf에 3 분 동안 원심 삭제는 상쾌한, 부드럽게 bFGF/EGF 무료 (GBM) glioma 셀 매체의 1 mL에 구체를 resuspend 하 고는 셀. 약 104 분야/ml (105 셀/mL)에 GBM-셀 밀도 조정 합니다. 우물에서 폴 리 D lysine을 무시 하 고 그들을 씻어 살 균 PBS 가진 3 배. 시드 3 mL/종양 회전 타원 체 서 스 펜 션의 플레이트와 종양 세포 현 탁 액에 BBB 모방으로 삽입 전송. 밤새 품 어 (37 °C 5 %CO2)는 혈액과 뇌 사이의 평형 분석 결과의 종양 측면 있도록. 다음 날에서 EBM-관심의 분자/마약/나노 보충 혈액 측면에서 미디어를 바꿉니다. 이전 섹션에 설명 된 대로 샘플 직접 정량화에 대 한 시간이 지남에 수집 됩니다. 셀 형광 이미징에 대 한 정확한 시간에 고정 (2.1과 2.2 절을 참조 하십시오). 2.는 BBTB의 고해상도 Confocal 영상 참고: 4 %paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, BBTB 복제 당 6 mL) PBS에 신선한 준비가 항상 되어 있습니다. 얼음에 그것을 유지. 주의: PFA는 발암 성. 니트 릴 글러브를 사용 하 여 처리 PFA 화학 증기 두건에서 솔루션을 준비 하. 꽉 접합 단백질의 BBTB 내 피 식 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 막의 양쪽 린스 (3 x 5 분, 2.5 ml/삽입, 3 mL/음). PBS를 삭제 하 고 3 mL 및 얼음 4%의 2.5 mL 추가 PFA 우물 및 삽입, 각각. 10 분 삭제는 PFA ice에 품 어 (‘기관에 따르면 s 유해 화학 처리) RT (2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 PBS 가진 3 배를 씻어.참고: 일단 고정, 샘플 저장할 수 있습니다 (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘) PBS에 4 °C에서 1 주일에 대 한. 면봉을 사용 하 여 삽입의 두뇌 측면을 닦 고 제거는 이다. 두 개의 수직 컷, 십자가 형성 하 여 4 개의 동등한 조각으로 막을 잘라 신중 하 게 날카로운 메스를 사용 하 여. 다음, 막 삽입 벽에 연결 된 지점에서 메스를 삽입 하 고 회전 하는 4 개의 샘플을 해방 하는 다른 한 손으로 삽입. 24-잘 접시 200 µ L의 PBS/잘 각 잘에서 혈액 쪽으로 포함 된 각 샘플 전송 신중 하 게 좋은 족집게를 사용 하 여. 10% 태아 둔감 한 혈 청 PBS에서 (대 한 실시간, 200 µ L/우물에서 30 분)와 막 차단 합니다. 단백질 (그림 1D) 꽉 접합의 immunostaining에 대 한 1° 항 체 솔루션을 준비 (zonula occludens-1, claudin-5; 테이블의 자료를 참조 하십시오) 솔루션/잘 차단의 200 µ L에서. 필요한 경우, 내 피 세포 정체성 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM1 또는 CD31; 테이블의 자료를 참조 하십시오)에 대 한 각 꽉 접합 항 체 솔루션을 제기 하는 항 체를 추가 하 여 확인 됩니다. 차단 솔루션을 삭제 하 고 기본 항 체’ O/N 4 °c.에서 함께 품 어 다음 날, 1 차 항 체를 삭제 하 고 PBS의 200 µ L로 씻 (3 배 RT에서 5 분). 적절 한 종의 fluorophore 활용 된 이차 항 체와 그들을 품 어 (1: 500 희석, 200 µ L/잘 차단 솔루션에 희석; 테이블의 자료를 참조 하십시오) 실시간에서 2 h 2 차 항 체, PBS의 200 µ L 린스 (3 배 RT에서 5 분). PBS를 제거 하 고는 4′, 1 μg/mL의 순수 증류수 H2O (dH2O; 200 µ L/잘; 테이블의 자료를 참조 하십시오 최종 농도에서 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션을 사용 하 여 셀 핵 counterstain ). DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 품 어 고 막 3 세척 dH2O와 x (200 µ L/잘). 설치 매체의 드롭 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 유리 현미경 슬라이드에서. 고급 핀셋을 사용 하 여, 신중 하 게 잘 막 꺼내 고 방향을 유지, dH2O의 초과 제거 하 고 설치 매체의 드롭에. 막 위에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가 하 고 신중 하 게 커버는 커버 글라스와. 없는 봉된 기포 확인 합니다. Confocal 현미경 관찰까지 4 °C에서 그리고 멀리 빛 샘플을 저장 합니다.참고: 사이토 얼룩이 24-잘 접시 선택한 사이토 특정 항 체의 사용과, 두뇌 쪽에에서 막의 조각을 배치 하 여 수행할 수 있습니다 (예: 폐해 fibrillary 산 성 단백질 [GFAP]에 대 한 감독) (그림 1E ). BBTB 형광 나노 transcytosis를 검출 하기 위하여 얼룩 라이브 셀 리소좀 라벨을 수행 (예: 형광등을 사용 하 여 조사 [ 테이블의 자료를 참조]). 50의 작업 농도에서 리소좀 형광 염료 희석 prewarmed EBM-nM (2.5 mL/삽입) 또는 prewarmed ABM-75 m m (3 mL/음)는 리소좀에 대 한 이다, 내 피 세포의 각각 라벨. 45 분에 대 한 셀을 품 어 (37 °C 5 %CO2); 다음, 얼음 처럼 차가운 PBS (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘)를 가진 3 배 린스. PBS를 삭제 하 고 3 mL 및 얼음 4%의 2.5 mL 추가 PFA는 잘 하 고 삽입, 각각. PFA 10 분 삭제에 대 한 얼음에 그들을 품 어 및 3 셀 린스 (RT, 2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 PBS 가진 x.참고: 일단 고정, 샘플 수 저장 PBS (2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 4 ° C에서 1 주일에 대 한. PBS를 제거 하 고 세포 핵 (1 mL/삽입, 1 mL/잘) dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 counterstain. DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 그들을 품 어 고 막 3 세척 dH2O (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘) x. 신중 하 게 막 잘라, dH2O, 초과 제거 하 고 설치 매체의 한 방울에 ( 재료의 표참조) 유리 현미경 슬라이드에서. 막의 반대편에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가 하 고 신중 하 게 커버는 커버 글라스와. 봉된 공기 방울을 피하십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 이미징까지 빛 으로부터 보호 유지. 형광 종양 세포의 얼룩 고급 핀셋을 사용 하 여 신중 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS 가득 24-잘 접시에 종양 분야를 포함 하는 라운드 coverslips 전송. 라이브 셀 리소좀 75에서 형광 리소좀 프로브를 사용 하 여 라벨 진행 prewarmed GBM-nM (200 µ L/잘). 45 분;에 대 한 샘플을 품 어 다음, 그들을 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 3 배 (200 µ L/잘). PBS를 무시 하 고 잘 당 차가운 PFA의 200 µ L를 추가 합니다. 10 분 삭제는 PFA ice에 품 어와 린스 샘플 3 (RT)에 PBS 가진 x.참고: 일단 고정, 샘플 PBS에 저장할 수 있습니다 (200 µ L) 일주일에 4 ° C에서. PBS를 제거 하 고 세포 핵 dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 counterstain (200 µ L/잘). DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 그들을 품 어와 coverslips 3 세척 dH2O와 x (200 µ L/잘). coverslip 꺼내 dH2O, 초과 제거 하 고 설치 매체의 한 방울에 정밀한 핀셋을 사용 하 여 참조 테이블의 재료유리 현미경 슬라이드에서. 어떤 기포 entrapping 하지 마십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 관찰까지 빛 으로부터 보호 유지. 3. Vivo에서 비교 연구 BBB 통해 나트륨 fluorescein 유포의 현장에서 녹음 150 µ L 생리 솔루션에 50 nM 나 플로리다 솔루션의 준비. 37 °C 정 맥 배달 시에 솔루션을 유지. 케 타 민/xylazine 칵테일 (PBS에 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 300 µ L)의 복 주사와 마우스 anesthetize 깊은 마 취 설정 되 면 동물 그것의 체온을 유지 하기 위해 난방 패드를 놓습니다.참고: 10 주 오래 된 여성 건 함 의료 연구 연구소 (NMRI) 누드 immunocompromised 쥐 그림 2에 표시 하는 데이터를 가져오는 데 사용 되었습니다. 그러나,이 프로토콜은 immunocompetent와 immunocompromised 마우스에 적응. 마 취/무 통 방법은 과학자’에 s 재량. 그러나, 그것은 크게 증가 함에 따라 BBB 침투성18isoflurane 같은 흡입 마 취 권장 하지 않습니다. Stereotaxic 프레임에 마우스를 놓고 ( 재료의 표참조) 좋은 위, 결합 조직, 두개골을 정밀한 핀셋을 사용 하 여 부드러운 dilacerations 뒤 피의 세로 절 개를 수행. 왼쪽 또는 오른쪽 정수 리 뼈에서 두개골의 ø 0.3 m m 원형 조각 제거 원형 움직임 좋은 microdrill를 사용 하. 훈련 하는 동안, 그리고 기본 meningeal 조직과 혈관 부상 피하려고 두개골 조각을 제거 하는 동안 극단주의 함께 진행. 노출 된 조직에 생리 적 솔루션의 한 방울을 놓습니다. 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 조심 스럽게 뇌 피 질에 액세스 하려면 meningeal 조직 제거. 뇌 조직의 공기 직접 접촉에 않을 것입니다.참고: 작은 출혈 meningeal 부상에서 혈액 스폰지를 사용 하 여 중지 할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오). 일단 meningeal 조직을 제거 하 고 피 질 완전히 노출, 피 질과 ø 0.5 m m 붕 coverslip 사이 생리 적인 솔루션의 한 방울을 모 함. Cyanoacrylate 접착제의 방울으로 관찰 영역을 확보 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) 바늘으로는 coverslip 주위에 확산. 하자 1 분 동안 건조 접착제. 꼬리 정 맥 주입 (그림 2A)에 대 한 매 카 테 터를 준비 합니다. 로체스터 Ochsner 집게를 사용 하 여 25 G 바늘의 팁 휴식과 팁 10 cm 긴 PE20 폴리우레탄 튜브에 삽입 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) (그림 2A). 불독 클램프를 사용 하 여 카 테 터 조작 및 삽입에 대 한 마우스의 측면 꼬리 정 맥에 카 테 터를 삽입 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) (그림 2B). 보안 cyanoacrylate 접착제 한 방울과 함께 삽입 된 바늘. 하자 20 건조 접착제 불독 클램프를 제거 하기 전에 s. 조심 스럽게 나 플로리다 솔루션 (그림 2B)를 포함 하는 주사기에 연결 25 G 바늘에 테의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 참고: 불독 클램프;와 꼬리를 클램프 하지 마십시오 또한 정확한 테 처리에만 사용 됩니다. 적절 한 카 테 터 삽입은 투명 한 튜브에 혈액 역류에 의해 확인할 수 있습니다. 장소는 stereomicroscope에서 동물 ( 재료의 표참조). 녹색 채널에 낮은 수준의 autofluorescence를 사용 하 여 (480 nm), (그들은이 파장에 빛의 헤모글로빈 흡수로 인해 어두운 표시) 비교적 큰 혈관과 작은 모세 혈관 (그림 2C)를 포함 하는 지역에 초점. 배경 형광의 측정을 형광 염료를 주입 하기 전에 간단히 시간 경과 수집을 시작 합니다.참고: 또한, 시간 경과 기록 T0에서 스냅숏 그림으로 대체 될 수 있습니다 및 어떤 다른 시간 포인트를 미리. 느리고 지속적인 속도로 솔루션을 주입 하거나 또는 자동된 주입 시스템을 사용 하 여. 혈액에서 감지 나 플로리다 형광 안정적으로 유지 한다 (혈액에서 하프 라이프: 286 분), 몇 분 동안 두개골 창을 통해 BBB 확산의 녹음을 수 있는. 인수 완료 되 면 신중 하 게 카 테 터를 제거 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 동물 안락사. BBB 침투성의 생체 조건 결정참고: 값 (ROI)의 사용자 지정 영역 내 형광 신호 강도 측정을 수 있도록 ImageJ, 등 어떤 이미지 처리 소프트웨어에서 가져옵니다. 뇌 조직에서 혈관, 외부 사각형 모양의 ROI를 그리기 주석 도구를 사용 하 여, 약 5 µ m에서 어떤 눈에 보이는 혈관에서 거리 가득한 나 층 참고 수익과 그 수익에 (T0)에서 측정 된 형광 강도의 크기는 사용 됩니다 빈 조직’s autofluorescence. 투자 수익을 전치 하지 않고 postinjection 시간 (예를 들어, 마지막 기록 된 프레임 전체 솔루션은 동물에 주입 되어 때) 하 고 투자 수익 (그림 2C) 내에서 측정 된 정확한 시간 및 형광 값을 참고 빨리. 보이는 혈관 (그림 2C)에 투자 수익을 이동 하 고 혈액에서 T0 autofluorescence 값. 3.2.1 단계에서 정의 된 투자 수익을 전치 하지 않고 같은 시간 지점으로 빨리. 그리고 형광 값 ROI (그림 2C) 내에서 측정 하는 참고. 다음 수식 (단면도 1.3에서 적응)를 사용 하 여 BBB 침투성을 결정. 여기, dF두뇌 는 두뇌에 T0 빈 값을 뺀 형광 강도 값 dT 수집 시간 포인트 초에서, A는 평방 센티미터, 그리고 에 투자 수익 영역으로 대략적인 선박 표면적 dF 혈액 혈액에 T0 빈 값을 뺀 형광 강도 값이입니다.참고: BBB에 대 한 예상된 침투성 값 (표 1) 10-6 c m/s 범위에 있어야 합니다. 조직 murine 뇌에 형광 나노 입자의 검출에 대 한 처리 마 취 6 주 된 여성 NMRI 누드 생쥐에서 신체 callosum에 세포종 환자에서 파생 된 분야 (살 균 PBS의 5 µ L에서 5 x 104 세포)를 이식. 이 두뇌 지구는 Bregma에서 시작 다음 stereotaxic 좌표를 찾습니다: anteroposterior + 0.5 m m, 왼쪽 오른쪽 + 2.5 m m, dorsoventral + 3 m m. 2 주 동안 성장 뇌종양 허용. 나노 입자를 정 맥 주사 (무 균 생리 적 솔루션의 100 µ L에서 100 µ g) 8 헤 주입 제어 마우스 정 맥 무 균 생리 적 솔루션의 100 µ L에 대 한 순환 수 있도록. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사 하 고 빠르게 스냅-동결 isopentane 드라이 아이스 (-50 °C에서 1 분)에서 유지 관리에 대 한 두뇌를 수집 합니다. 조직 처리까지-80 °C에서 두뇌를 저장 합니다. cryomicrotome와 코로나 뇌 섹션을 잘라. 그것은 피 질에 형성 하 고 적절 한 현미경 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 그 지역에서 9 µ m 두께 섹션을 잘라 흉터에 의해 intracranial 주입을 찾습니다. 얼음 처럼 차가운 PBS에 슬라이드에 움직일 두뇌 섹션을 담가 (2 x 5 분), 다음, 얼음 4%에 그들을 수정 하 고 PFA (5 분)에 대 한. PBS에서 슬라이드를 세척 (3 배 RT에서 5 분). 슬라이드를 가로로 놓고 피펫으로 차단 솔루션 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 PBS에 조직에 섹션 (RT, 500 µ L/슬라이드에서 1 시간)에 대 한 전체 표면을 커버 합니다. CD31 항 체를 준비 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) 차단 솔루션/슬라이드의 250 µ L에서. 항 체로 차단 솔루션을 장착 하 고 하룻밤에 4 °C 습도 챔버에 품 어. 다음 날, 담가 PBS에 슬라이드 (RT 5 분에 대 한 3 배)는 해당 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (1: 500에 RT에서 2 h에 대 한 PBS의 250 µ L)으로 그들을 품 어 고. (RT)에 PBS에 3 x 린스와 dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 셀 핵 counterstain (250 µ L/슬라이드). 7 분 실시간 제거 DAPI 솔루션에 대 한 샘플을 품 어와 슬라이드 3을 씻어 dH2O. x 각 조직 섹션에서 추가 설치 매체의 한 방울 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오)는 coverslip로 샘플을 확보 하 고. 공기 방울 entrapping 하지 마십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 관찰까지 빛 으로부터 보호 유지.