JoVE Journal > Immunology and Infection
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Inmunología y contagio

人类舱内单聚物研究病原体、共脉和宿主肠道上皮细胞之间的相互作用

Published: April 09, 2019
doi:
10.3791/59357
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

在这里, 我们提出了一个培养人类肠体或类团类单层具有完整的屏障功能的方案, 以研究宿主上皮微生物在细胞和生化水平上的相互作用。

Abstract

从隐基干细胞中提取的人三维 (3D) 肠内酯或类殖民细胞培养物是目前肠道上皮最先进的体外模型。由于其封闭的结构和显著的支持细胞外基质, 3D 培养物不是理想的宿主病原体研究。肠内或菌落可以作为上皮单层生长在可渗透组织培养膜上, 以允许操作腔内和亚外侧细胞表面及伴随的液体。这种增强的腔表面可及性有助于模拟细菌-宿主上皮的相互作用, 如结肠上皮肠出血性大肠杆菌(ehec) 的粘液降解能力。介绍了一种三维培养碎裂、单层播种和超相电阻 (TER) 测量的方法, 以监测融合和分化的进展。结肠样单层分化产生分泌粘液, 可通过免疫荧光或免疫印迹技术进行研究。更广泛地说, 肠内或结肠样单层使生理相关的平台能够评估可能成为致病性或同源微生物群目标的特定细胞群。

Introduction

肠道有机体、肠体和菌落在了解干细胞行为、肠道发育、屏障运输功能和细胞分化方面取得了许多进展。1然而, 3d 培养限制了宿主上皮病原体相互作用的研究, 因为细菌或毒力因素不能直接接触到腔内, 除非封闭结构受到微注射。2,3此外, 分泌的材料, 如小分子、蛋白质或粘液, 不能很容易地从3d 培养中取样, 以便进行下游分析。在3D 培养中, 使用荧光染料和延时显微镜对病原体对上皮屏障功能4和离子转运5的影响进行了评价, 但在透水组织培养支架上生长的单层菌是可以接受的其他技术, 如 TER 测量和使用室电压夹记录。6,7.

许多出版物描述了肠结肠炎/结肠炎的2D 或单层培养协议。被发现促进上皮细胞附着的材料包括胶原蛋白水凝胶,8,9 0.1% 明胶,10薄层小鼠肉瘤衍生基底膜基质 (bmm),11,12, 13和人胶原蛋白 iv。6,7.,14,15,16,17种入途径包括通过移液6、14、15 和使用胰蛋白酶、10、11 的细胞粘附因子分离进行机械碎裂消除,13或 edta。9一些协议使用无孔组织培养塑料制品进行播种, 但这限制了基外侧访问, 因此大多数应用依赖于渗透组织培养插入物。不同出版物之间有稳定的融合单层形成和维护的文献。此外, 不同群体的人类文化增长和差异化媒体成分不同, 并随着更多的研究人员采用和调整方法以适应其应用和现有资源而不断演变。

为了解决在宿主-病原体相互作用研究中3D 肠道上皮培养的局限性, 我们提出了一种改进的协议, 用于将3D 人类肠体或菌落转换为单层。在隐状样未成熟状态下实现融合后, 生长因子 WNT3A、RSPO1 和抑制剂 a-83-01 和 SB 202190 的退出可导致小肠绒毛或表面结肠上皮的分化代表。我们描述理想的基质, 人胶原蛋白类型 iv, 以覆盖插入物, 并获得均匀的肠内或结肠样碎片电镀。我们证明, 该协议产生了一个融合单层具有较高的 ter. 结肠样单层分泌一个厚的顶端粘液层, 允许通过免疫印迹或免疫染色对病理-粘液相互作用进行体外研究。还介绍了一种改进的固定程序, 以保持结肠粘液层的免疫染色。该方法旨在为研究感染后肠道宿主-病原体相互作用提供一个可追溯的模型。

Protocol

该协议以作者先前发表的研究报告为基础。6,7.,14,15,16应使用适当的无菌技术, 在无菌生物安全柜中采取以下步骤。所有涉及人体标本的方法都已得到约翰·霍普金斯大学医学院机构审查委员会 (IRB NA_00038329) 的批准。 1. 用细胞外基质插入涂层细胞培养 在 100 mM 醋酸中制备5毫升的胶原蛋白 iv 溶液 (1 Mg/ml)。让支架在4°c 下大约 4小时, 以充分水合溶解。 在 4°C (≤ 1个月) 或-20°c (> 1个月) 的温度下, 将胶原蛋白 iv 库存溶液储存。 在涂布之前, 将无菌组织培养等级的水中的胶原蛋白 IV 库存溶液稀释到34Μg/ml 的最终浓度。对于24孔板细胞培养刀片, 在每个刀片上涂上100Μl 的溶液, 相当于 10μgcm 2。 在37°c 的标准 co2 组织培养孵化器中孵育板≥ 2小时, 或为方便起见, 用石蜡膜密封板边缘, 在4°c 下隔夜或最多1周孵育。 2. 从3D 培养中分离肠内病/菌落 注: 肠类或类鸦片是根据前面描述的标准协议从捐献者活检中建立起来的, 并在3D 培养中保持。14,简单地说, 通过螯合和机械搅拌从肠道活检或切除中收获的隐窝。在 BMM 中, 这些墓穴被清洗、收获和镀。扩展介质 (步骤4.2 中描述) 将添加到区域性中, 并每2天更换一次。电镀后数小时内就能看到3D 培养的形成。 从24孔板中吸收培养基, 每口用1毫升冰凉收获液 (见材料表) 代替。 使用一个微型细胞刮刀, 以驱逐和破坏地下室膜基质颗粒, 特别注意任何材料附近的井边。 在约200转/分、4°C 的轨道振动台上搅拌板30-45。 3. 分离3D 肠内病/结肠炎 使用 P200 单通道移液器或装有无菌滤嘴的多通道移液器对细胞悬浮液进行三度处理。 将细胞悬浮液集中在一个15毫升的锥形小瓶中。如果悬浮总量 > 6 毫升, 请使用多个小瓶。 加入同等体积的先进 DMM/F12 培养基, 含有 10 mM HEPES、l-丙基-l-谷氨酰胺二肽 (1x) 和青霉素-链霉素 (1x) (洗涤介质)。反转管3-4 次混合。离心机在 300 x 克, 10分钟, 4°C。 (可选) 吸气洗涤介质, 并替换为 0.5 mll/井胰蛋白酶 (见材料表)。用 P200 移液器重新注射结肠炎, 将管盖上, 放在37°c 的水浴中大约 2分钟, 立即取出管, 将洗涤介质添加到10毫升的最终体积, 并按照步骤3.3 中的步骤第3.3一次离心。注: 如果三化不会导致大小均匀的碎片, 则此步骤可能更可取。 4. 电镀肠内/结肠吊乳 如果涂层刀片保存在 4°c, 平衡在 37°cc% co% 2 组织培养孵化器中至少 30分钟, 然后再电镀细胞。 对于要电镀的每个插入物, 制备1毫升温 (25-37°c) 膨胀介质 (EM), 并添加 10μm Y-27632 和 10μm CHIR 99021。注: EM 由包含 B27 (1x) 的高级 DMM/F12 组成, 50% WNT3A 条件培养基, 15% RSPO1 调理培养基, 10% Noggin 条件培养基, 50 Ng/ml 人 egf, 500 nM a-83-01, 10μm sb 202190, 抗生素抗真菌鸡尾酒 (1x), 10 mM HEPPES,L-丙基-l-谷氨酰胺二肽 (1x) 和青霉素链霉素 (1x) (见材料表)。 将含有细胞颗粒的导管中的洗涤介质吸出, 并重新悬浮在足以产生至少100μl 插入物的 em 中。 从每个插入物中吸走胶原蛋白 IV 溶液, 每次插入时使用150Μl 的洗涤介质清洗两次。 将600Μl 的 em 移入每个刀片下方的空间。 将细胞悬浮液100Μl 插入每个插入物中。 将钢板返回组织培养孵化器, 并保持至少12小时不受干扰。注: 避免晃动或大幅倾斜板, 以防止结肠绿殖民体碎片在插入膜上的分布不均。 通过将电池连接置于 2.5 x-10倍物镜下的相对比光显微镜上, 监测细胞附件并展开以形成融合单层。 1-2天后, 大部分片段应粘附在胶原蛋白基质上。刷新培养基, 停止用 Y-27道理和 CHIR 99021 处理。继续每2-3天刷新一次介质, 直到融合。融合通常在7-10 内达到。 5. 测量上皮电阻 将电极引线连接在上皮电压计 (EVOM) 上并通电。验证测量功能是否设置为欧姆。 用70% 乙醇短暂浸渍电极尖端, 并用实验室组织擦干。在洗涤介质的5毫升中平衡电极约5分钟。 将较短的电极尖端浸入插入介质中, 并将较长的电极尖端定向到较低的井板中。保持电极在一个完全垂直的方向, 直到 EVOM 读数相对稳定, 或不超过60秒。注: 如果电极组件倾斜远离垂直, 或尖端高度调整不当, 较短的尖端可能会接触并破坏电池单层。 将 EVOM 测量值与从培养基中淹没的无细胞插入物中获得的值进行比较, 以评估融合或分化的进展。 6. 融合肠内/结肠样单层的分化 将 EM 交换为差异介质 (DM), 并继续每两天刷新一次介质, 直到第5天。DM 是缺少 WNT3A、RSPO1、A-83-01 和 SB 202190 的 EM。 继续监视 TER, 以验证差异化是否按预期进行。在分化的第一天至 5点, ter 将继续增加。单层可能会在5-6 之后继续增加 TER 并保持活力, 但在5-6 使用时, 会显示出最大和最可重现的结果。 7. 细菌感染, 同型或致病性大肠杆菌 在实施感染前一天, 用无抗生素 em 或 DM 清洗和喂养单层。 使用无菌微生物循环轻轻刮掉冷冻细菌性甘油库存的表面, 并接种2毫升的 LB 肉汤。将试管转移到37°c 的标准晃动孵化器12-16小时。 将起始培养的50μl 稀释为5毫升新鲜 lb 肉汤 (1: 100), 并继续孵育90分钟。这将产生密度为 10 5-10 6个菌落单元 (cfu )/ll 的原木相培养。 (可选) 在分光光度计中通过600纳米 (OD600) 的光学密度测量来确认细菌浓度。 将细菌培养在 12, 000 x 克下 10分钟, 去除上清液, 并将细菌重新悬浮在不含抗生素的 EM 或 DM 中, 最终浓度为 107 cfu ml。 在插入物中加入10μl 的细菌悬浮液 (最终浓度为 106 cf ml)。管慢慢混合, 避免干扰细胞外粘液层。 将钢板返回到组织培养孵化器, 以达到所需的感染期。 8. 固定保存和免疫粘液 将细胞培养物从24孔板上提起, 小心倒置在实验室纸巾上, 取出顶端介质, 并擦拭粘附在刀片上的外部液体。 在一个新的24孔板, 将插入物浸泡在1:3 溶液中的冰醋酸在绝对乙醇 (克拉克的溶液) 在室温下10分钟。 倒置插入物, 去除固定物, 将细胞在 1x PBS 中补充水分 10分钟. 继续使用标准的免疫染色方案。 使用剃须刀刀片切割刀片膜的周长。使用钳子将膜转移到玻璃显微镜幻灯片上, 并用安装介质贴上覆盖玻璃。 9. 免疫印迹细胞裂解液的制备 注: 在冰上或在冷藏室执行以下步骤。 吸气介质, 用 PBS 清洗插入一次。 在插入物中加入150Μl 裂解缓冲液 (见材料表), 让支架 5-10. 裂解缓冲液含有 50 mM Tis ph 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL ca-630, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, 1100: 蛋白酶抑制剂鸡尾酒。 使用微型细胞刮刀从插入物中取出细胞, 然后使用 P200 移液器短暂三度将悬浮液转移到微型离心管中。 使用微尖端探头以20% 的振幅将具有 5 x 1 s 脉冲的悬架进行对其进行扫描 (参见材料表)。 如果立即进行电泳, 则添加 SDS-PAGE 加载缓冲液, 或将脂肪和裂解液储存在-20°c。

Representative Results

人类肠内和殖民体培养体是作为三维结构生长的, 然后分离和分裂, 用于在人体胶原蛋白 iv 涂层细胞培养插入物上电镀。通过明亮的场显微镜、免疫荧光染色 (图 1) 和经皮电阻 (ter) 的稳步增加 (图 2), 每天都可以很容易地监测单层的形成过程 (图 2), 这反映了紧密连接与离子的渗透性及其与单层融合的关系。一个空的24孔刀片的 TER 约为 50-100是不是 2摄氏度,达到融合后增加到大约 400-500是不是 cm 2.融合单层中的所有上皮细胞都通过在细胞周长的 f-肌动蛋白环检测到的结合点复合物连接 (图 1)。全生长因子介质中的单层代表增殖性隐窝状上皮, 主要由包含核苷类似 edu 的主动分裂细胞组成 (图 2)。RNT3A 和 RSPO1 的生长因子的退出促进了分化, 导致缺乏增殖细胞的绒毛样培养物。分化的单层含有肠细胞 (肠素) 或菌落细胞 (菌落), 并发展专门的肠道上皮细胞, 如3D 培养所示,18包括杯状细胞和肠内分泌细胞。15差异化单层还显示出 ter (≫ 1000ωcm 2) 显著增加 (图 2), 表明成熟紧密的连接点。 在正常的人体生理中, 肠道上皮层将营养物质和富含微生物的腔内空间与无菌的血清学环境分离开来。上皮紧密地调节这两个隔间之间的交叉谈话。肠体和结肠组体单层保存这一重要的条块分割性质, 如表 1中的蛋白质组学分析所示。从分化的肠内单层中收集的顶端和同外侧条件培养基的蛋白质组成存在显著差异。通过访问顶端和基外侧, 可以以时间相关的方式收集这两种上清液, 以测量其他分子 (如细胞因子和趋化因子) 的差异分泌。15,17 单层是一种方便且高重现性的模型, 可同时使用免疫印迹和免疫染色检测蛋白质表达的变化。因此, 使用这两种技术都可以检测到 shRNA 敲除 (KD) 在粘液 2 (MUCIN) 表达中的变化 (图 3)。在3D 类殖民细胞上进行了 shRNA 转导, 并在抗生素选择介质中保持。在验证 KD 后, 殖民体可以作为3D 区域性连续维护, 或作为单层进行电镀, 用于实验目的。此外, 与野生型亲本殖民体线相比, MUC2 KD 不影响单层形成的效率。收集用于免疫印迹的单层是简单的, 类似于人类上皮腺癌衍生细胞系的描述方案。通常情况下, 大约50微克或更多的总蛋白可以从一个0.33 厘米2插入生长的单层中提取。如图 3所示, 在未分化 (ud) wt 类殖民类单层中几乎无法检测到 muc2, 但在差异化 (df) wt 单层中表达得很高。在与 MUC2 shRNA 转化的 UD 和 DF 类殖民细胞单层中, MUC2 均低于检测水平。 重要的是, 单层是研究上皮顶端表面的宿主-微生物相互作用的合适模型。结肠样单层在分化时形成厚的附着的 mucus 阳性粘液层, 不容易被大肠杆菌 (图 4)渗透(图 4), 类似于正常的人结肠中的建议。19然而, 肠出血性大肠杆菌(ehec) 是一种人类结肠病原体, 已被证明有能力破坏富含 mucus 的附着粘液层, 以到达上皮的顶端表面 (图 4)。14,20剩余的 muc2 只存在于杯状细胞内。 图 1:人肠内/结肠样单层的建立.(A)在 bmm 溶解和三化之后的结肠炎片段的例子。(B)电镀结肠样碎片后立即插入的例子。刻度杆 (A-B) = 200 微米。代表(c)最大强度投影和(d)共聚焦光学 z-部分与相应的正交投影显示, 在人类胶原蛋白 iv 涂层过滤器上播种的殖民体片段形成多个单层岛屿2-4天后播种。C 和 D 中都没有核 (Hoechst 33342, 蓝色) 和顶端 f-肌动蛋白 (phalloidin, 绿色) 染色, 就可以识别无细胞区 (星号). 与相应的正交投影部分显示, 在播种后1周左右, 用 f-肌动蛋白免疫染色检测到连续的顶层表面。(G)具有代表性的最大强度投影和(h)共聚焦光学截面的高放大倍率与相应的正交投影表明, 融合的结肠组类单层中的细胞形成 f-肌动蛋白周围的结合点环 (白色箭头) 和一个不成熟的尖刷边框 (黄色箭头)。刻度杆 (C-H) = 20μm。请点击这里查看此图的较大版本. 图 2: 肠内样/结肠药单层分化的评估。(A) edu (红色) 合并表明在空肠单层分化过程中逐渐失去增殖。(B)膨胀或分化介质中融合空肠单层的平均 ter 测量值。错误条代表 SEM. UD, 未区分;DF, 区分。数字对应于指定条件下的天数;UD1 是融合的第一天, 大约在播种后1周。(C) ud 空肠单层具有宽, 短的细胞和一个不太成熟的顶端的基于关键的刷边界比 df 天5空肠单层。刻度杆 (A, C) = 50 微米。所有单层都被描绘至少1周后播种和融合之前开始分化。请点击这里查看此图的较大版本. 图 3:野生型殖民体和 shRNA 转染 (kd) 类殖民体各形成融合单层。(A)具有代表性的人类融合类殖民层单层图像, 区分了 5天, (b)来自 MUC2 kd 殖民文化的类似生长的单层。结垢条 (A-B) = 50μm (c)代表的结肠样体培养体免疫印迹与拼接的 SHRNA 或 Uc2 shRNA 一起转化, 表明 kd 引起的蛋白质表达的变化可以通过免疫印迹进行定量。请点击这里查看此图的较大版本. 图 4: 肠内/结肠样单层是研究腔内微生物-宿主相互作用的合适模型.(A)具有代表性的结肠样单层最大强度投影和正交光学切片显示厚顶端的 muc2 阳性粘液层, 不能渗透到位于顶端粘液处的大肠杆菌hs (黑色箭头)表面。单层感染 6小时, 用 10 6 Cfu/mL hs.(B)代表性人类殖民样单层的最大强度投影, 顶部感染 ehec (106 cfukl, 6小时)。刻度杆 (A-B) = 50μm。(C) muc2 免疫荧光强度测量显示, 与未感染对照组相比, 受 ehec 感染的结肠组类单层的 muc2 显著下降。错误条表示 SEM. 请点击此处查看此图的较大版本. 蛋白 加入号码 多肽丰富 基外侧介质 脂肪酸结合蛋白, 肝脏 [智人] NP_001434。1 1299 profilin-1 [智人] NP_005013。1 797 载脂蛋白 A-IV 前体 [智人] NP_000473。2 744 Ecto-adp-核糖基转移酶4前体 [智人] NP_066549。2 633 甘油三-磷酸脱氢酶等形态 1 [智人] NP_002037.2 (+ 1) 616 血清转铁蛋白前体 [智人] NP_001054.1 (+ 1) 572 维生素 d 结合蛋白等体3前体 [智人] NP_001191236.1 (+ 2) 567 过氧化氢酶 [智人] NP_001743。1 427 异型1前体 [智人] NP_940978.2 (+ 1) 377 乳铁蛋白异种1前体 [智人] NP_002334.2 (+ 1) 36S 专题媒体 三叶草因子3前体 [智人] NP_003217。3 22 w 三叶草因子1前体 [智人] NP_003216。1 304 基底膜特异性肝素硫酸盐蛋白聚糖核心蛋白异基因等体 [智人] NP_001278789.1 (+ 3) 303 丝状物-b 异形 1 [智人] NP_001157789.1 (+ 2) 240 三叶草因子2前体 [智人] NP_005414。1 182 删除恶性脑肿瘤1蛋白异形 b 前体 [智人] NP_015568.2 (+ 3) 169 角蛋白, II 型细胞骨架 1 [智人] NP_006112。3 157 肌球蛋白 9 [智人] NP_002464。1 150人 氨基肽酶 N 前体 [智人] NP_001141.2 (+ 1) 145 农业前体 [智人] NP_940978.2 (+ 1) 112 表1。从分化的空肠单层中取样的顶端和亚外侧流体中, 通过液相色谱/串联质谱法识别的部分肽列表。

Discussion

成功形成肠内样单层的关键参数包括 1) 健康、增殖的3D 文化作为起始材料;2) 在单层播种前, 用人胶原蛋白 iv 涂覆细胞培养表面;3) 机械或酶上的3D 培养体的碎片化, 但不分散到单个细胞级别。

在三维肠内结石的分离过程中, 最佳的晃动速度可能会根据给定振动台模型的旋转直径而变化。这样做的目的不仅是为了高效混合而搅拌板材, 而且也是为了避免将细胞悬浮液溅到板盖上或相邻的井中。< 30分钟的潜伏期可能会产生残留的 BMM 粘附在细胞上, 这可能会阻碍在插入物上镀片时附着和形成均匀的细胞单层。广泛的孵育 (≥1小时) 将导致细胞活力显著降低。

分离三维肠溶特类化合物所需的三位一体程度可能随活塞刚度和使用者的灵活性而变化。建议在相对比光显微镜上定期检查井内含量, 以确定片段在三化过程中的均匀性, 目标是每个片段大约30个细胞。作为代替, 或除了三化, 悬浮液可以用胰蛋白酶短暂消化, 以获得较小的均匀碎片。如果单层在一个单一的上皮层中含有很大比例的3d 样结构, 则可能需要使用胰蛋白酶消化。然而, 与单细胞的离解是不可取的, 因为这显著降低细胞的活力。在 35Μl BMM 液滴中培养的肠系膜/类原体的一口通常足以填充2-3 个插入物, 但这一因素可能因肠类/结肠滴的数量和平均大小而异。

结肠样单层可以吸收大量的顶端介质, 因为他们区分。这可以通过在上插入室 (150-200μl) 上应用额外的 DM 来规避, 尽管上腔的部分干燥似乎不会对单层的生存能力或下游检测中的功能产生不利影响。经过大约4-5 的分化, 结肠这种单层细胞外粘液在仔细抽吸 DM 后, 可能会在细胞表面显示为厚胶状物质。

对于 EHEC 与外部粘液层的相互作用, 我们通常使用协议中规定的细菌滴度和潜伏期。然而, 独特的菌株最初应检测在多个浓度和潜伏期, 以确定适当的参数所需的效果。

在粘液固定过程中, 吸气顶端介质可能会去除大部分细胞外未附着的粘液层。因此, 仔细倒出介质是很重要的。如果介质被表面张力保留在刀片中, 请使用折叠的实验室组织的角, 以打破表面张力, 并将大部分介质擦掉。固定和染色后, 在插入滤镜上安装覆盖玻璃时, 粘液层可能会被无意中移开或扁平。为了保持粘液高度, 请将滤清器放在安装介质的一滴上, 并小心地将覆盖玻璃放在过滤器上。不要点击或按下覆盖玻璃, 因为这可能会显著压平粘液层。

为了在三维培养中从细胞中形成偏振单层, 有必要重现肠上皮细胞的亚外侧膜整合与细胞外基质 (ECM) 蛋白之间的相互作用。层压板、胶原蛋白 IV、纤维连接蛋白和一系列蛋白聚糖构成肠道上皮 ECM。21,22我们比较了人类细胞衍生的层压蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白 iv 和穆林衍生的 bmm 作为插入涂层。只有胶原蛋白 IV 支持形成稳定的、长期的 (长达 4周) 的融合肠样单层 (图 1-2)。在其他测试矩阵上获得了少量的单层样生长, 但这些区域未能进展到融合。使用人胶原蛋白 iv 作为 ECM 替代品有许多优点。来自恩格尔布雷斯-霍尔姆-群 (EHS) 小鼠肉瘤细胞的 BMM 不是人类的起源, 而人类胶原蛋白 IV 是商业上可用的, 通常更具成本效益。此外, BMM 是一种具有固有变异性的蛋白质的复杂混合物, 可能包含由影响基因表达的肉瘤分泌的生长因子。23

肠道上皮细胞与肠道上皮恢复中的潜在 ECM 之间的相互作用仍未完全了解。胶原蛋白 IV, 但不是层压蛋白的意义, 作为一个粘附配体对人殖民地细胞 24 和肠道隐窝上皮细胞恢复25的增强剂已建议使用抗体对胶原蛋白 iv, 防止附着.作为Β-1-整合素的抗体, 在菌落细胞对 IV 型胶原蛋白的粘附中表现出明显的阻断抗体, 上皮表达的β1-整合素似乎对 ECM 相互作用很重要。虽然胶原蛋白 iv 为插入物上的肠样单层形成提供了可靠的 ecm, 但随着时间的推移, ecm 的上皮重塑尚未在该模型中得到评估, 也没有更复杂和定义的 ecm 混合物的影响。胶原蛋白 IV、层压蛋白和纤维连接蛋白。

人类肠杆菌/单层形式的结肠炎 (图 1-4) 使操作和采样成为可能, 使用三维矩阵嵌入的培养物将是繁琐或不可能实现的。三维肠杆菌/菌落在大小、结构复杂性和管腔体积上各不相同, 因此微生物或小分子的微注射很难准确定量。此外, 与单层 (表 1) 不同的是, 3d 培养物阻止直接进入腔内和基底外侧表面, 以测量与生理或病理生理过程相关的离子、营养物质、细胞因子或分泌因素.融合 (图 1-2) 是肠内样单层的主要特性之一, 不仅需要建立营养物质、离子和其他大分子的生理梯度,而且要创造适当的屏障在腔内微生物群和无菌间充质/免疫细胞居住的浆膜环境之间。这些方面是重要的考虑, 未来的研究, 纳入肠内样单层与间充质, 免疫, 或神经元细胞类型, 以建立更复杂的生理模型。

这里描述的细胞培养插入模型的局限性包括缺乏物理力, 如流体剪切应力和机械拉伸压缩 (蠕动), 以及缺乏通常经历肠道的厌氧顶端环境体内上皮。这些元素有可能通过更复杂的微生理平台26来解决,但它们也需要额外的费用、设备和专门知识来实施。3D 和单层培养物也没有与肠道微生物群、基质细胞群和免疫系统的相互作用或贡献, 除非有目的地添加这些成分。

肠内样单层在胶原蛋白 iv 包膜细胞培养插入物中的未来应用可能包括其他关于致病性或同源微生物相互作用、药物或营养吸收、毒性、代谢、屏障功能和功能的研究由与其他肠道细胞类型共同培养的增强。评估不仅可以在健康捐献者的上皮内进行, 还可以从有基因突变或肠道疾病的个体进行评估, 前提是体内表型被确定为保存在体外肠内/结肠组培养中。

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了国家卫生研究院的支持, 该项目提供了 P01 AI125181、K01 DK106323 (JGI) 和 K01 DK113043 (JFA)。我们感谢詹姆斯·卡普 (马里兰州立大学、巴尔的摩、医学博士、美国) 提供大肠杆菌株 HS 和 ehec。我们还感谢霍普金斯霍普金斯·霍特消化系统基础和转化研究核心中心 (P30 DK089502) 和约翰霍普金斯质谱和蛋白质组学核心的综合生理和成像核心。

Materials

2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor
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Referencias

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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).
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