مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للثقافة البشرية انتيرويد أو مونولاييرس كولونويد التي لها وظيفة الحاجز سليمة لدراسة التفاعلات الظهارية الحجمية المضيف على المستوى الخلوي والكيمياء الحيوية.
Abstract
3-الأبعاد (3D) انتيرويد أو كولونويد الثقافات الإنسانية المستمدة من الخلايا الجذعية قاعدة القبو حاليا السابقين فيفو النموذج الأكثر تقدما من ظهارة الأمعاء. بسبب هياكلها مغلقة والمصفوفة خارج الخلية الداعمة الهامة، 3D الثقافات ليست مثالية للدراسات المضيف الممرض. انتيرويدس أو كولونويدس يمكن أن تزرع مونولاييرس الظهارية في زراعة الأنسجة نفاذية الأغشية للسماح للتلاعب على حد سواء لومينال وأسطح الخلية باسولاتيرال والسوائل المرافقة. وييسر هذا الوصول السطحية لومينال المعززة نمذجة التفاعلات البكتيريا المضيفة طلائي مثل القدرة المهينة المخاط من انتيروهيمورهاجيك كولاي (الإشريكيّة) على ظهارة colonic. ويرد وصف طريقة لتجزئة الثقافة 3D، وبذر أحادي الطبقة، وقياسات المقاومة الكهربية (ثالثا) ترانسيبيثيليال لرصد التقدم المحرز نحو كونفلوينسي والتمايز. كولونويد أحادي الطبقة التمايز غلة يفرز المخاط التي يمكن دراستها باستخدام تقنيات الفلورة أو إيمونوبلوتينج. وبصورة أعم، تمكن مونولاييرس انتيرويد أو كولونويد منصة ذات صلة بالناحية الفسيولوجية لتقييم السكان الخلية المحددة التي قد تكون مستهدفة من قبل الحجمية المسببة للأمراض أو كومينسال.
Introduction
أورجانويدس المعوية، وانتيرويدس، وكولونويدس أدت إلى العديد من أوجه التقدم في فهم سلوك الخلايا الجذعية، ووظيفة الحاجز والنقل والتنمية المعوية والتمايز الخلوي. 1 ولكن الثقافة 3D يحد دراسة التفاعل الظهارية الممرض المضيف التجويف غير قابل للوصول مباشرة للبكتيريا أو عوامل الفوعة ما لم يتعرض الهياكل المغلقة إلى microinjection. 2 , 3 بالإضافة إلى ذلك، يفرز مواد مثل الجزيئات الصغيرة، البروتينات، أو لا يمكن تذوق المخاط بسهولة من الثقافة ثلاثي الأبعاد لتحليل المتلقين للمعلومات. وقد تم تقييم أثر العوامل المسببة للأمراض في الحاجز الظهارية الدالة4 وأيون النقل5 في الثقافة ثلاثي الأبعاد باستخدام الأصباغ الفلورية والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، ولكن مونولاييرس نمت على نفاذية الأنسجة الثقافة يدعم قابلة تقنيات إضافية مثل تير قياس وتسجيل المشبك الدائرة/التيار الكهربائي أوسينج. 6 , 7
وقد وصف العديد من المنشورات البروتوكولات للثقافة 2D أو أحادي الطبقة من انتيرويدس/كولونويدس. وتشمل المواد التي وجدت لتعزيز مرفق الخلايا الظهارية الكولاجين الهلاميات المائية، الجيلاتين 0.1%9 8،،10 طبقة رقيقة مورين المستمدة من ساركومه الغشاء مصفوفة (بم)،،،من1112 13 والكولاجين البشرية الرابع. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 وتشمل النهج استمطار تجزئة الميكانيكية التي بيبيتينج6،،من1415 و/أو الانفصال من عوامل التصاق الخلية باستخدام التربسين،،من1011 ديسباسي،13 أو يدتا. 9 استخدام بروتوكولات قليلة بلاستيكواري زراعة الأنسجة غير المسامية للبذر، ولكن هذا يقيد الوصول باسولاتيرال، حيث معظم تطبيقات تعتمد على إدراج نفاذية زراعة الأنسجة. الوثائق المتعلقة بتشكيل المونولاير المتلاقية مستقرة وصيانة تفاوتاً كبيرا فيما بين المنشورات. بالإضافة إلى ذلك، التراكيب وسائط النمو والتمايز للثقافات الإنسانية تختلف فيما بين مختلف المجموعات، وتستمر في التطور باعتماد المزيد من الباحثين وضبط المنهجية لتناسب التطبيق والموارد المتاحة.
ولمعالجة أوجه قصور الثقافة الظهارية المعوية 3D في دراسات التفاعل المضيف الممرض، نقدم بروتوكول تعديل لتحويل 3D انتيرويدس البشرية أو كولونويدس إلى أحادي الطبقة. بعد تحقيق كونفلوينسي في سرداب مثل دولة غير ناضجة، والانسحاب من عوامل النمو WNT3A، و RSPO1، ومثبطات 202190 س وألف-83-01 يؤدي إلى تمايز الممثل زغابة معوية صغيرة أو ظهارة colonic السطحية. يصف لنا مصفوفة مثالية، الكولاجين البشرية النوع الرابع، معطف إدراج والحصول على شظايا انتيرويد أو كولونويد موحدة للطلاء. نظهر أن ينتج هذا البروتوكول أحادي الطبقة المتلاقية مع ارتفاع مونولاييرس كولونويد مكررا تفرز طبقة سميكة مخاط قمي، مما يسمح لدراسات السابقين فيفو مخاط الممرض التفاعل عن طريق إيمونوبلوتينج أو إيمونوستينينج. ويرد أيضا إجراء تعديل تثبيت للحفاظ على طبقة المخاط colonic إيمونوستينينج. هذا الأسلوب يهدف إلى توفير نموذج المرونة دراسة التفاعلات المعوية المضيف-الممرض أقرب إلى الإصابة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتضمن معلمات الحاسمة لنجاح تشكيل مونولاييرس انتيرويد/كولونويد 1) صحية، تنتشر 3D الثقافات بداية من المواد؛ 2) طلاء السطح إدراج ثقافة الخلية مع الكولاجين البشرية الرابع قبل البذر أحادي الطبقة؛ 3) تجزؤ 3D الثقافات أما ميكانيكيا أو انزيماتيكالي، ولكن ليس على مستوى الخلية الواحدة.
أثناء عزلة 3D انتيرويدس/كولونويدس، يمكن أن تختلف سرعة الهز الأمثل حسب القطر التناوب من نموذج معين شاكر. القصد هو ليس فقط تحرض اللوحة للاختلاط كفاءة، ولكن أيضا تجنب الرش تعليق خلية على غطاء لوحة أو في الآبار المجاورة. قد تسفر عن فترات حضانة من < 30 دقيقة متبقية بم التشبث بالخلايا، والتي يمكن أن تعوق مرفق وتشكيل خلية موحدة مونولاييرس عند مطلي بشأن إدراج. حضانة واسعة النطاق (≥ ح 1) سوف تسفر عن بقاء الخلية انخفض إلى حد كبير.
يمكن أن تختلف مدى تريتوريشن المطلوبة لفصل 3D انتيرويدس/كولونويدس مع براعة المكبس المستخدم وصلابة. لتحديد جزء من التوحيد خلال تريتوريشن، بهدف خلايا حوالي 30 كل جزء يوصي بالفحص الدوري لمحتويات جيدا في مجهر تباين مرحلة خفيفة. التعليق بدلاً من، أو بالإضافة إلى تريتوريشن، يمكن هضمها بإيجاز مع التربسين للحصول على أصغر أجزاء موحدة. قد يكون من المستصوب إذا مونولاييرس تحتوي على نسبة كبيرة من هياكل مثل 3D بين طبقة طلائي إلا واحد هضم التربسين. الانفصال إلى خلايا مفردة غير مرغوب فيه، وهذا يقلل بشكل ملحوظ بقاء الخلية. بئر واحدة من انتيرويدس/كولونويدس المستزرعة في معالجة تجميعية بم ميكروليتر 35 يكون بصورة عامة ما يكفي لملء إدراج 2-3، ولكن هذا العامل يمكن أن تختلف تبعاً لعدد وحجم متوسط من انتيرويدس/كولونويدس.
مونولاييرس كولونويد قد استيعاب حجم كبير من المتوسط قمي كما أنها تفرق. وهذا يمكن التحايل عليها بتطبيق إضافية مارك ألماني إلى الدائرة إدراج العلوي (150-200 ميكروليتر)، على الرغم من أن تجفيف مجلس الشيوخ لا يبدو أن تؤثر سلبا على سلامة أحادي الطبقة أو دالة في الاختبارات النهائية. بعد حوالي 4-5 أيام للتمايز، وضع مونولاييرس كولونويد المخاط خارج الخلية التي قد تكون مرئية كمواد هلامية/سميكة على سطح الخلية بعد تطلع حذراً من مارك ألماني.
القولونية التفاعل مع طبقة المخاط الخارجي، نستخدم بشكل روتيني البكتيرية عيار والحضانة الفترة المحددة في البروتوكول. ومع ذلك، ينبغي في البداية جزيئي السلالات البكتيرية فريدة من نوعها في تركيزات متعددة وفترات حضانة لتحديد المعلمات المناسبة للتأثير المطلوب.
أثناء تثبيت المخاط، يسفط المتوسطة قمي المحتمل سيزيل معظم طبقة المخاط فاتحة خارج الخلية. ولذلك، من المهم أن صب بدقة المتوسطة. إذا كان يتم الاحتفاظ المتوسطة في الإدراج بالتوتر السطحي، استخدام الركن من الأنسجة المختبرية مطوية لكسر التوتر السطحي والفتيل بعيداً أكثر من المتوسط. بعد التثبيت وتلطيخ، يمكن عن غير قصد فكها طبقة المخاط أو سويت بالأرض بينما تصاعد كوفيرجلاس على إدراج عامل التصفية. للحفاظ على ارتفاع المخاط، وضع عامل التصفية على قطره من تركيب وسائط ووضع بعناية كوفيرجلاس على عامل التصفية. لا انقر أو اضغط على كوفيرجلاس كهذا قد تتسطح إلى حد كبير في طبقة المخاط.
بشكل أحادي استقطاب الطبقة من الخلايا في ثقافة 3D، من الضروري أن تستنسخ التفاعل بين basolateral integrins غشاء الخلايا الظهارية المعوية والبروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). رابعا الكولاجين وفيبرونيكتين، Laminin ومجموعة من بروتيوجليكانس تشكل ECM الظهارية المعوية. 21 , 22 قارنا laminin المستمدة من الخلايا البشرية، فيبرونيكتين، الكولاجين الرابع، والمستمدة من الفاري بم كإدراج الطلاء. فقط الكولاجين الرابع يؤيد تشكيل مستقر وطويل الأجل (تصل إلى 4 أسابيع) مونولاييرس انتيرويد/كولونويد المتلاقية (الأرقام 1-2). وتم الحصول على بقع صغيرة من أحادي الطبقة مثل النمو في كل من اختبار المصفوفات الأخرى، ولكن فشلت هذه المناطق للتقدم إلى كونفلوينسي. استخدام الكولاجين البشرية الرابع كمركب ECM لديها عدد من المزايا. بم المستمدة من انجيلبريث-هولم-سرب (EHS) الخلايا ساركومه مورين ليسوا من أصل البشرية، بينما الكولاجين البشرية الرابع عموما أكثر فعالية من حيث التكلفة والمتاحة تجارياً. بالإضافة إلى ذلك، بم هو خليط معقد من البروتينات مع تقلب الملازمة، وقد تحتوي على عوامل النمو التي يفرزها ساركومه التي تؤثر على التعبير الجيني. 23
التفاعلات بين الخلايا الظهارية المعوية والمحتوى الأساسي في رد الظهارية المعوية المفهوم لا يزال غير كامل. وقد اقترح أهمية الكولاجين الرابع، ولكن لا لامينين، بوصفها يجند التصاق كولونوسيتيس البشرية24 ومحسن للخلايا الظهارية المعوية سرداب رد25 استخدام الأجسام المضادة ضد الكولاجين الرابع التي حالت دون المرفقات . أعرب طلائي β1-إنتغرين يبدو هاما لتفاعل إدارة المحتوى في المؤسسة، كما حظر جسم معين ل β1-إنتغرين كثيرا انضمام كولونوسيتيس نوع الكولاجين الرابع. 24 بينما يوفر الكولاجين الرابع إدارة المحتوى في المؤسسة موثوق بها لأحادي الطبقة انتيرويد/كولونويد تشكيل على إدراج، الظهارية يعيد البناء من إدارة المحتوى في المؤسسة مرور الوقت ما لم يقيم في هذا النموذج، ولا له تأثير خلائط ECM أكثر تعقيداً ومحددة من الكولاجين الرابع، لامينين، وفيبرونيكتين.
انتيرويدس/كولونويدس البشرية في شكل أحادي الطبقة (الأرقام 1-4) تمكين التلاعب وأخذ العينات التي ستكون مرهقة أو من المستحيل تحقيق استخدام الثقافات جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ثلاثية الأبعاد. 3D انتيرويدس/كولونويدس تختلف في الحجم والتعقيد الهيكلي، وحجم لومينال، وهكذا يصعب microinjection ميكروبات أو جزيئات صغيرة من كوانتيتاتي بدقة. خلافا مونولاييرس (الجدول 1)، بالإضافة إلى ذلك، منع الثقافات 3D الوصول المباشر إلى الأسطح لومينال وباسولاتيرال لقياس الأيونات، والعناصر الغذائية، السيتوكينات أو يفرز العوامل المرتبطة بالعمليات الفسيولوجية أو باثوفيسيولوجيك . كونفلوينسي (الأرقام 1-2) واحدة من الخصائص الرئيسية لأحادي الطبقة انتيرويد/كولونويد اللازمة لوضع ليس فقط التدرجات الفسيولوجية للمواد الغذائية، والايونات، والأخرى الجزيئات،16 ولكن أيضا إنشاء الحاجز السليم بين الحجمية لومينال والوسيطة/المناعة العقيمة المأهولة بالخلية من بيئات سيرسال. هذه الجوانب هامة للنظر في الدراسات المستقبلية التي تتضمن مونولاييرس انتيرويد/كولونويد مع أنواع الخلايا الوسيطة، ومحصنة، أو العصبية لبناء نماذج الفسيولوجية أكثر تعقيداً.
تشمل القيود لاحظ نموذج إدراج ثقافة الخلية الموصوفة هنا عدم وجود القوات المادية مثل السوائل القص إجهاد وتمتد الميكانيكية/ضغط (التمعج)، وعدم وجود بيئة قمي اللاهوائية عادة من ذوي الخبرة بالامعاء المجراة في ابيثيليا. هذه العناصر لها القدرة على معالجة أكثر تطورا من منصات ميكروفيسيولوجيكال،26 ولكنها تتطلب أيضا نفقات إضافية، والمعدات والخبرة اللازمة لتنفيذ. 3D وأحادي الطبقة الثقافات أيضا دون المساهمات من ميكروبيومي المعوية، والسكان الخلية اللحمية، والجهاز المناعي أو التفاعلات مع ما لم يتم إضافة هذه المكونات هادف.
التطبيقات المستقبلية المونولاير انتيرويد/كولونويد على إدراج الثقافة الخلية المغلفة بالرابع الكولاجين قد تشمل دراسات أخرى للتفاعل الميكروبية المسببة للأمراض أو commensal، الإقبال على المخدرات أو المواد الغذائية، وسمية، والايض، وظيفة الحاجز، والوظيفية تعزيز تحفزها ثقافة المشارك مع أنواع إضافية من الخلايا المعوية. ويمكن إجراء تقييمات ليس فقط داخل epithelia المانحين صحية ولكن أيضا من الأفراد مع الطفرات الوراثية أو الاضطرابات المعوية، شريطة أن تعمل المجراة في إنشاء للاحتفاظ بها في السابقين فيفو انتيرويد/كولونويد الثقافة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة منح P01 AI125181 و K01 DK106323 (ججي) K01 DK113043 (الاتحاد الياباني). ونحن نشكر جيمس Kaper (جامعة ميريلاند، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير كولاي سلالة HS والقولونيه. ونقدر أيضا فسيولوجيا متكامل والتصوير النوى في هوبكنز كونتي الجهاز الهضمي الأمراض الأساسية ويشغل مركز البحوث الأساسية (P30 DK089502) و “جونز هوبكنز الكتلي” والبروتينات الأساسية.
Materials
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
| Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
| Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
| Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
| Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
| HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
| Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
| Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
| Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
| Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
| MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
| MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
| Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
| Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
| Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
| Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
| Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |
Referencias
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132 (2017).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138 (2015).
- Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, (2016).
- Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
- Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351 (2018).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
- Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911 (2015).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296 (2017).
- Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett’s Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
- Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717 (2017).
- Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340 (1982).
- Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
- Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
- Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
- Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).
