Identificação de fatores nucleolares durante a replicação do HIV-1 através da imunoprecipitação de Rev e espectrometria de massas

O nucléolo é postulado como a terra da interação de vários anfitrião celular e fatores virais exigidos para a replicação viral. O nucléolo é uma estrutura complexa subdividida em três compartimentos diferentes: o compartimento fibrilar, o compartimento fibrilar denso, e o compartimento granulado. A proteína HIV-1 Rev localiza-se especificamente dentro de compartimentos granulados; no entanto, a razão para este padrão de localização é desconhecida. Na presença de mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev 4, 5, e 6), o Rev mantem um teste padrão nucleolar e foi mostrado previamente para resgatar a replicação do HIV-1_HXB2 , entretanto, com eficiência reduzida comparada ao peso rev¹ . Todas as mutações de ponto único são incapazes de sustentar o ciclo infeccioso HIV-1_NL4-3 . Na presença de múltiplas mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev-NoLS 2 e 9), o Rev tem sido observado para dispersar em todo o núcleo e citoplasma e não tem sido capaz de resgatar o HIV-1_HXB2 Replication¹. O objetivo deste estudo do proteômica é decifrar nucleolar assim como fatores celulares nonnucleolar envolvidos no caminho infeccioso HIV-1 mediado por Rev. As condições de imunoprecipitação do Rev são otimizadas através da interação com a fosfoproteína B23 nucleolar, que tem sido mostrada anteriormente para perder a interação com o Rev na presença de mutações nucleolar.

Os fatores celulares do Rev têm sido extensivamente estudados no passado; Entretanto, isto foi feito na ausência de patogénese viral. Uma proteína, em particular, que se caracteriza neste estudo através da interação Rev durante a replicação do HIV-1 é a fosfoproteína nucleolar B23-também chamada nucleophosmin (NPM), numatrina, ou NO38 em anfíbios^{2,3, 4}. B23 é expressado como três isoformas (NPM1, NPM2, e NPM3)-todos os membros da família nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmin acompanhante^5,6. A Chaperona molecular NPM1 funciona na montagem adequada de nucleossomas, na formação de complexos de proteínas/ácidos nucleicos envolvidos em estruturas de ordem superior de cromatina^7,8, e na prevenção de agregação e desdobramento de proteínas alvo através de um domínio de núcleo N-terminal (resíduos 1-120)⁹. A funcionalidade NPM1 estende-se à gênese Ribossome através do transporte de partículas preribosomal entre o núcleo e o citoplasma^10,11, o processamento de RNA preribosomal na seqüência ^{interna do espaçador transcrito 12,13}, e prendendo a agregação nucleolar das proteínas durante a montagem ribossomal^14,15. A NPM1 está implicada na inibição da apoptose¹⁶ e na estabilização dos supressores tumorais ARF^17,18 e p53¹⁹, revelando seu duplo papel como fator oncogênico e supressor tumoral. NPM1 participa nas atividades celulares de estabilidade do genoma, replicação centrosome, e transcrição. NPM1 é encontrado nos nucléolos durante a interfase do ciclo de pilha, ao longo da periferia cromossomática durante a mitose, e em corpos prenucleolar (PNB) na conclusão do mitosis. NPM2 e NPM3 não são tão bem estudados quanto NPM1, o que sofre níveis de expressão alterados durante a malignidade²⁰.

NPM1 é documentado no shuttling Mimivírus de várias proteínas nucleares/nucleolar através de um NES interno e de NLS^9,21 e foi relatado previamente para conduzir a importação nuclear de HIV-1 tat e de proteínas do Rev. Na presença de proteínas de fusão B23-Binding-Domain-β-galactosidase, Tat mislocalizes dentro do citoplasma e perde a atividade de transativação; Isso demonstra uma forte afinidade de tat para B23². Outro estudo estabeleceu um complexo estável Rev/B23 na ausência de mRNAs contendo RRE. Na presença de RRE mRNA, o Rev dissocia-se de B23 e liga-se preferivelmente ao HIV RRE, conduzindo ao deslocamento de B23²². Não se sabe onde, no nível subnuclear, a transativação do tat e o processo de troca do Rev de B23 para o HIV mRNA acontecem. Ambas as proteínas são postuladas para entrar no nucléolo simultaneamente através da interação B23. O envolvimento de outras proteínas celulares hospedeiras na via nucleolar do HIV é esperado. Os métodos descritos nesta investigação do proteômica ajudarão a elucidar o interação do nucléolo com os fatores celulares do anfitrião envolvidos durante a patogénese de HIV-1.

A investigação proteômica foi iniciada através da expressão de mutações de ponto único do Rev NoLS (M4, M5 e M6) e múltiplas substituições de arginina (m2 e M9) para a produção de HIV-1_HXB2 . Neste modelo, uma linha celular de HeLa que expressa estàvel a Rev-deficiente HIV-1_HXB2 (hlfb) é transfected com as mutações NUCLEOLAR do peso Rev e do Rev que contêm uma etiqueta da bandeira na extremidade 3 ‘. A presença do WT Rev permitirá a replicação viral ocorrer na cultura do HLfB, em comparação com as mutações do Rev-NoLS que não resgatam a deficiência de Rev (m2 e M9), ou permitem que ocorra replicação viral, mas não tão eficientemente quanto o WT Rev (M4, M5 e M6)¹. O lisado da pilha é coletado 48 h mais tarde após a proliferação viral na presença da expressão do Rev e ser submetido à imunoprecipitação com um tampão do lysis aperfeiçoado para a interação de Rev/B23. A otimização do tampão de Lise usando concentrações de sal variáveis é descrita, e os métodos da eluição da proteína para o Rev do HIV-1 são comparados e analisados em géis prata-manchados ou Coomassie-manchadas da SDS-página. A primeira abordagem proteômica envolve a análise direta de uma amostra eluída de WT Rev, m2, M6 e M9 expressos por espectrometria de massas em tandem. Uma segunda abordagem pela qual os eluatos do WT Rev, M4, M5 e M6 foram submetidos a um processo de extração de gel é comparado com a primeira abordagem. A afinidade peptídica para mutações do Rev-NoLS em comparação ao WT Rev é analisada e a probabilidade de identificação de proteínas é exibida. Essas abordagens revelam potenciais fatores (nucleolar e não nucleolar) que participam do transporte do mRNA do HIV-1 e da emenda com o Rev durante a replicação do HIV-1. Globalmente, as condições de lise celular, IP e eluição descritas são aplicáveis às proteínas virais de interesse para a compreensão dos fatores celulares hospedeiros que ativam e regulam as vias infecciosas. Isso também é aplicável ao estudo de fatores de acolhimento celular necessários para a persistência de vários modelos de doença. Neste modelo proteômica, o HIV-1 Rev IP é otimizado para a interação B23 para elucidar fatores nucleolares envolvidos na atividade de shuttling Mimivírus e na ligação do mRNA do HIV-1. Adicionalmente, linhas celulares que expressam estavelmente modelos de doenças infecciosas que são deficientes para proteínas-chave de interesse podem ser desenvolvidas, semelhante à linha celular HLfB, para estudar as vias infecciosas de interesse.