זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

הנוקלאוולוס שוכן כשטח האינטראקציה של מגוון מארח הסלולר והגורמים הנגיפים הדרושים לשכפול נגיפי. הנוקלאוולוס הוא מבנה מורכב החולק לשלושה תאים שונים: תא fibrillar, תא fibrillar צפוף, והתא הגרגירים. החלבון HIV-1 הפוך מכיל במיוחד בתוך תאים גרגירים; עם זאת, הסיבה לתבנית הלוקליזציה אינה ידועה. בנוכחות של מוטציות חד הנקודה בתוך רצף NoLS (מוטציות Rev 4, 5, ו 6), Rev שומר על דפוס נוקלאוולאר והוכח בעבר להציל HIV-1_HXB2 שכפול, עם זאת, עם יעילות מופחתת לעומת WT Rev¹ . כל המוטציות של נקודה אחת אינן מאפשרות לקיים את המחזור הזיהומיות של HIV-1_NL4-3 . בנוכחות מוטציות מרובות נקודה אחת בתוך הרצף NoLS (מוטציות Rev-NoLS 2 ו -9), Rev כבר נצפתה להתפזר לאורך הגרעין הציטופלסמה ולא הצליח להציל HIV-1_HXB2 שכפול¹. המטרה של מחקר זה פרוטאומניקס היא לפענח נוקלאוולאר, כמו גם גורמים סלולריים nonnucleolar מעורב במסלול Rev-מתווך HIV-1 מדבקת. התנאים Rev immunoprecipitation ממוטבים באמצעות אינטראקציה עם נוקלאוולאר B23 פוספופפרוטאין, אשר בעבר הוכח לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות נוקלאוקולאר.

Rev הגורמים הסלולריים נחקרו בהרחבה בעבר; עם זאת, זה נעשה בהעדר פתוגנזה נגיפית. חלבון אחד, במיוחד, כי הוא מאופיין במחקר זה באמצעות הפוך אינטראקציה במהלך שכפול HIV-1 הוא נוקלאוולאר פוספהוופפרוטאין B23-נקרא גם נואופהוסמרין (npm), numatrin, או NO38 דו חיים^{2,3, 4}. B23 מתבטא כשלוש איזוforms (NPM1, NPM2 וNPM3)-כל חברי המשפחה הגרעינית/נואופלמיסמין משפחת מלווה בנשק גרעיני^5,6. המלווה המולקולרי NPM1 פונקציות בהרכבה נאותה של נוקלאוטיזומים, בהקמת מתחמי חומצות חלבון/גרעין המעורבים במבנים מסדר גבוה כרומטין^7,8, ובמניעת צבירה ו קיפול חלבונים של יעד דרך מתחם ליבה N-terminal (שאריות 1-120)⁹. NPM1 פונקציונליות מרחיב הריבוכמה בראשית דרך התחבורה של חלקיקים preriboזומתיים בין הגרעין לציטופלסמה^10,11, עיבוד של preriboזומא ברצף ^{החלל הפנימי של מועתק 12,13}, ומעצר את צבירת הנוקלאוולאר של חלבונים במהלך מכלול הריבוזומיום^14,15. NPM1 הוא מעורב עיכוב של אפופטוזיס¹⁶ ו בייצוב של הגידול דכאי arf^17,18 ו p53¹⁹, חשיפת תפקידה הכפול כגורם אונגניים ומדכא הגידול. NPM1 משתתפת בפעילות התאית של יציבות הגנום, שכפול הסנטרוכמה ותמלול. NPM1 נמצא נוקלאופולי במהלך המחזור הפנימי של מחזור התא, לאורך הפריפריה הרומוזומלית במהלך mitosis, ו ב prenucleolar גופים (PNB) בתום מיטוזיס. NPM2 ו NPM3 אינם למדו כמו NPM1, אשר עובר רמות ביטוי משתנה במהלך ממאירות²⁰.

NPM1 מתועדת המעבר נוקלאוציטופטומיק של חלבונים גרעיניים/נוקלאוולאר שונים דרך נס פנימי ו-NLS^9,21 בעבר דווחה לכונן את היבוא הגרעיני של HIV-1 תאת והפוך חלבונים. בנוכחות של B23-הדומיין-β-גלטוסידאז היתוך חלבונים, תאת מאחרבתוך הציטופלסמה ומאבדת פעילות הפעלה; זה מדגים אהדה חזקה של תאת עבור B23². מחקר נוסף הקים מתחם יציב Rev/B23 בהעדר של mRNAs המכיל את הקובץ. בנוכחות של בעל mRNA, Rev הנתק מ B23 ונקשר בעדיפות ל-HIV עם, המוביל לעקירה של B23²². זה לא ידוע איפה, ברמה הגרעינית תת, תאת ההפעלה ואת תהליך המרת Rev של B23 עבור HIV mRNA להתרחש. שני החלבונים מוצדדים להיכנס לנוקלאוולוס בו זמנית באמצעות B23 אינטראקציה. מעורבות של חלבונים סלולריים אחרים מארחים בנתיב הנוקלאוולאר של HIV צפוי. השיטות המתוארות בחקירה הפרוטסטנטית הזאת תסייע להבהיר את הגומלין של הנוקלאוולוס עם גורמים סלולאריים מארחים המעורבים במהלך הפתוגנזה HIV-1.

החקירה פרוטאומיקס הופעל באמצעות הביטוי של Rev nols מוטציות חד הנקודה (M4, M5, ו M6) והחלפות ארגינין מרובים (M2 ו-M9) עבור HIV-1_HXB2 הייצור. במודל זה, קו של תא של הלה ביטוי באופן מופתי Rev-1_HXB2 (hlfb) הוא מנוכר עם WT rev ומוטציות הפוך הכולל תג דגל בסוף 3 ‘. הנוכחות של WT Rev יאפשר שכפול ויראלי להתרחש בתרבות HLfB, בהשוואה מוטציות Rev-NoLS כי לא להציל מחסור Rev (M2 ו M9), או לאפשר שכפול נגיפי להתרחש אבל לא ביעילות כמו WT Rev (M4, M5, ו M6)¹. ליפוסט התא נאסף 48 h מאוחר יותר לאחר התפשטות ויראלי בנוכחות Rev הבעה ונתון immunoprecipitation עם מאגר לפירוק ממוטב עבור האינטראקציה Rev/B23. מיטוב מאגר לליזה באמצעות ריכוזי מלח משתנה מתואר, ושיטות החלבון של HIV-1 Rev מושווים ונותחו בכסף מוכתם או Coomassie מוכתם SDS-דף ג ‘ לים. הגישה הראשונה פרוטקוממיקס כרוכה בניתוח ישיר של דגימת שלווה מבוטא WT הפוך, M2, M6, ו M9 על-ידי טנדם ספקטרומטר מסה. הגישה השנייה שבה האלוטים של WT Rev, M4, M5, ו M6 עברו תהליך החילוץ ג’ל הוא לעומת הגישה הראשונה. פפטיד זיקה כדי Rev-NoLS מוטציות בהשוואה WT Rev מנותח ואת ההסתברות זיהוי חלבון מוצג. גישות אלה חושפים גורמים פוטנציאליים (נוקלאוקולאר ו-nonnucleolar) המשתתפים בתחבורה HIV-1 mRNA ושחבור עם Rev במהלך שכפול HIV-1. באופן כללי, פירוק התא, IP, ותנאי הימנעות מתוארים חלים על חלבונים ויראלי של עניין להבנת גורמים סלולריים מארחים המפעילים ומווסת מסלולים זיהומיות. הדבר חל גם על חקר גורמי מארח סלולריים הנדרשים להתמדה של דגמי מחלות שונות. במודל זה פרוטאומניקס, HIV-1 Rev IP ממוטב עבור B23 אינטראקציה כדי להבהיר גורמים נוקלאואוליאר מעורב בפעילות שיוט נוקלאוצילסמטי ו-HIV-1 mRNA מחייב. בנוסף, קווי התא המבטא באופן בלתי נשכח דגמי מחלות זיהומיות כי הם חסרים חלבונים מפתח של עניין ניתן לפתח, בדומה לקו התאים HLfB, כדי ללמוד מסלולים זיהומיות של עניין.