Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.
Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve genetische ziekte die wordt veroorzaakt door een gebrek aan functionele Dystrofine-eiwit. De ziekte kan niet worden genezen, en naarmate de ziekte vordert, ontwikkelt de patiënt symptomen van verwijde cardiomyopathie, aritmie en congestief hartfalen. De DMDMDX mutant muizen doen niet express Dystrofine en worden vaak gebruikt als een muismodel van DMD. In onze recente studie, die we hebben vastgesteld dat intramyocardial injectie van brede type (WT)-myogenic voorlopercellen cellen afkomstige exosomes (MPC-Exo) Transient hersteld de uitdrukking van Dystrofine in het myocardium van DMDMDX mutant muizen, die werd geassocieerd met een tijdelijke verbetering van de hartfunctie suggereren dat kan WT-MPC-Exo bieden een optie voor het verlichten van de cardiale symptomen van DMD. Dit artikel beschrijft de techniek van MPC-Exo-zuivering en transplantatie in het hart van DMDMDX mutant muizen.
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve, progressieve neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een mutatie in gen DMD en het verlies van functionele Dystrofine1. Dystrofine voornamelijk in skeletspieren en myocard wordt uitgedrukt, en minder wordt uitgedrukt in gladde spieren, endocriene klieren en neuronen2,3. DMD is de meest voorkomende vorm van spierdystrofie met een incidentie van één per 3.500 tot 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd4,5. Individuen ontwikkelen meestal progressieve spier necrose, verlies van onafhankelijke wandelen door vroege adolescentie, en dood in de decennia van de tweede naar de derde van hun leven als gevolg van hartfalen en respiratoir falen6.
Verwijde cardiomyopathie, aritmieën en congestief hartfalen zijn gemeenschappelijke cardiovasculaire uitingen van DMD7,8. De ziekte kan niet worden genezen, ondersteunende behandeling kan symptomen verbeteren of vertragen van de progressie van hartfalen, maar het is heel moeilijk om het hart functie9,10.
Soortgelijk aan DMD patiënten, spierdystrofie X-gebonden (MDX) muizen hebben een tekort in het Dystrofine-eiwit en huidige symptomen van cardiomyopathie11, en worden daarom veel gebruikt bij DMD verbonden cardiomyopathie onderzoek. Om te herstellen van Dystrofine in betrokken spieren, heeft allogene stamcel therapie bewezen een effectieve behandeling voor DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membraan blaasjes uitgescheiden door verschillende celtypes, spelen een sleutelrol in de cel-naar-cel communicatie via genetische materiaal vervoer, zoals messenger-RNA (mRNA) en niet-coderende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Onze vorige studies hebben aangetoond dat exosomes afgeleid van myogenic voorlopercellen (MPC), zoals C2C12 cellijn, Dystrofine kunt overbrengen mRNA naar host cardiomyocytes na directe cardiale injectie22, waarmee wordt aangegeven dat allogene levering van MPC-afgeleide exosomes (MPC-Exo) kunt Transient DMD genexpressie in MDX-muizen herstellen. Dit artikel richt zich op de zuivering en -transplantatie technieken MPC-Exo.
De methode van het isoleren van pure exosomes is essentieel voor de studie van de functie van exosomes. Een van de gebruikte technieken voor exosome isolatie is polyethyleen glycolen (pinnen) gemedieerde neerslag17,18,25. Exosomes kunnen worden neergeslagen in haringen en Ingehuld door lage snelheid centrifugeren. PEG-gemedieerde zuivering is erg handig, goedkope, hoeft niet alle geavanceerde apparatuur, maar er bestaat bezorgdh…
The authors have nothing to disclose.
Tang werden slechts gedeeltelijk ondersteund door de American Heart Association: GRNT31430008 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
Centrifuge | Unico | C8606 | |
Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
DMEM | Corning | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |