用荧光显微镜分析膜受体扩散和簇簇的图像处理协议
Summary
在这里, 我们提出了一个单一粒子跟踪图像分析的协议, 允许定量评估扩散系数, 类型的运动和集群大小的单个粒子检测到的荧光显微镜。
Abstract
视频序列上的粒子跟踪及其轨迹的后验分析是当今许多生物学研究中常见的操作。以细胞膜受体簇分析为模型, 我们提出了一个详细的协议, 这个图像分析任务使用斐济 (ImageJ) 和 Matlab 例程: 1) 定义感兴趣的区域和设计适应这些区域的面具;2) 跟踪荧光显微镜视频中的颗粒;3) 分析所选轨道的扩散和强度特性。通过荧光显微镜和图像处理获得的扩散系数、运动类型和聚类尺寸的定量分析, 为客观地确定粒子动力学和改性的后果提供了宝贵的工具。环境条件。在本文中, 我们提供了用于分析这些功能的详细协议。这里描述的方法不仅允许单分子跟踪检测, 而且还自动估计细胞膜上的横向扩散参数, 对轨迹类型进行分类, 并允许进行完整的分析, 从而克服在细胞膜上的整个轨迹上量化光斑大小的困难。
Introduction
由于热扩散, 脂质双层中的膜蛋白连续运动。它们的动力学对于调节细胞反应是必不可少的, 因为分子间的相互作用允许从单体到低聚物大小不同的复合物的形成, 并影响信号复合物的稳定性。因此, 阐明控制蛋白质动力学的机制是细胞生物学中的一个新挑战, 是理解信号转导途径和识别意外细胞功能所必需的。
研究这些在活细胞1中的相互作用的光学方法已经发展起来。其中, 在20世纪80年代初发展起来的总内部反射荧光 (TIRF) 显微镜, 可以研究细胞膜2处或非常近的分子相互作用.为了研究从活细胞中 TIRF 数据获得的膜蛋白轨迹的动态参数, 需要一种单一的粒子跟踪方法 (SPT)。虽然有几种算法可用于此, 但我们目前使用 Jaqaman 等人3发布的算法, 通过在连续帧之间连接粒子以连接生成的轨道来解决密集粒子场中粒子运动的异质性问题段转化为完整的轨迹 (暂时的粒子消失)。该软件捕获聚合和离解事件3所产生的粒子合并和分裂。该软件的输出数据之一是通过定义粒子在每个帧中的 X 和 Y 位置来检测整个轨迹上的粒子。
一旦检测到粒子, 我们应用不同的算法来确定短时间格扩散系数 (d-11-4)4,5。通过应用动量缩放谱 (mss)6、7、8分析或通过将均方位移 (msd) 调整到曲线 9来拟合 “alpha” 值, 我们还根据以下方式对粒子进行了分类:轨迹的类型。
荧光图像中的点强分析是该领域 10、11 的科学家共同的目标。最常用的算法是所谓的数字和亮度。尽管如此, 这种方法不允许在移动分数中的粒子中进行正确的逐帧强度检测。因此, 我们产生了一种新的算法来逐帧评估这些粒子强度, 并确定它们的聚合状态。一旦使用 U-track2 软件3检测到每个粒子的坐标, 我们就会在整个轨迹上定义每个帧中的强度, 同时考虑每个帧中的单元格背景。该软件提供了不同的可能性来确定点强度和细胞背景, 并使用已知的单体和二聚蛋白质作为参考, 计算所检测到的粒子中的蛋白质的大致数量 (簇大小)。
在本文中, 我们描述了一个仔细的指南, 以执行这三个步骤: 1) 检测和跟踪单个粒子沿荧光显微镜的视频 u 轨;2) 通过 MSS 分析这些粒子的瞬时扩散系数 (d1-4) 以及具有长轨迹的粒子的运动类型 (限制、自由或定向);3) 测量点强度沿视频校正的估计背景荧光为每个点。这样就可以估计聚类尺寸并识别光漂白步骤。
使用本协议不需要专门的技能, 可以在任何实验室进行细胞培养、流式细胞仪和显微镜设施。该协议使用 ImageJ 或斐济 (ImageJ12的分布)、u-trak3和一些临时制作的例程 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)。U 轨和临时例程运行在 Matlab 上, 可以安装在任何兼容的计算机上。
Protocol
Representative Results
Discussion
即使没有任何以前使用 Matlab 的经验, 所描述的方法也很容易执行。但是, Matlab 例程需要非常精确的不同命令的命名和程序使用的不同文件夹的本地化。在跟踪分析例程 (步骤 3) 中, 可以修改多个参数。”设置高斯混合模型拟合” 窗口 (步骤 3.8) 控制 u 轨如何检测视频上的单个粒子。这是通过拟合高斯混合模型来完成的, 如3所述。此管接头的关键参数之一定义了一个筛选器, 以帮助识…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢卡洛·曼佐和玛丽亚·加西亚·帕拉霍的帮助和扩散系数分析的源代码。这项工作得到了西班牙科学、创新和大学部 (SAF 2017-82940-r) 和 salud Carlos iii 研究所 (RD12\ 0009/00/PR-侵入 00/AG) 赠款的部分支持;里尔)。LMM 和 JV 得到了 CSIC 基金会 COMFUTURO 方案的支持。
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
Referencias
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