선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충), 살아있는 선 충 류, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하는 매력적인 모델로 떠오르고 있다. 제시 프로토콜이이 모델을 사용 하 여 H2O2의 생산을 통해 mitis 그룹 streptococci 기인한 pathogenicity 결정. Mitis 그룹 streptococci bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 봉와 직 염 등 많은 인간의 질병을 일으키는 원인이 되는 신흥 위협입니다. 여기에 설명 된 H2O2 에 대 한 응답에이 벌레의 생존을 결정 하는 프로토콜에 의해 생산 병원 체의이 그룹. 산화 긴장 응답 녹음 방송 요인에 대 한 유전자 skn-1 인코딩을 사용 하 여,이 모델은 연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하는 데 중요 한 표시 됩니다. 또한, 유전자 변형 기자 웜 변형, SKN-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 융합은 사용 하 여이 병원 균의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링할 수 있습니다 표시 됩니다. 이 분석 실험 것 반대로 생물 소스에 의해 파생 된 H2O2 로 산화 스트레스 반응을 기회 반응성 산소 종 (선생님) 소스를 추가 제공 합니다.
Mitis 그룹 streptococci oropharyngeal 구멍1의 인간의 공생입니다. 그러나, 이러한 생물이이 틈새를 탈출 하 고 침략 적인 질병2의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 이러한 미생물에의 한 감염 등 bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 cellulitis2,,34,,56. 또한, 그들은 혈 류 감염의 원인으로 대리인은 신흥 시내 immunocompromised, neutropenic, 그리고 화학 요법5,,78,9 받은 암 환자 .
몇 가지 독성 요인 확인 되었습니다 있기 때문에 기본 mitis 그룹 병 인은 애매 한 메커니즘. Mitis 그룹은 H2O2, 구강 미생물 커뮤니티10에서 중요 한 역할을 보여줘 생산으로 알려져 있다. 최근 여러 연구 cytotoxin 상피 세포 죽음11,12-유도로 H2O2 에 대 한 역할을 강조 했습니다. S. 폐 렴, 이 그룹에 속하는 DNA 손상 및13치경 세포 있는 apoptosis를 유도 하는 H2O2 의 높은 수준의 생산을 보였다. 급성 폐 렴 동물 모델을 사용 하 여, 동일한 연구원은 박테리아에 의해 H2O2 의 생산 독성 우위를 수 여 한다 설명 했다. 폐 렴 균 성 수 막 염에 대 한 연구 또한 그 병원 체 파생 된 H2O2 를 신경 세포 죽음14트리거 pneumolysin와 synergistically 역할 표시. 이 관측은 명확 하 게 박테리아의이 그룹에 의해 생산을 H2O2 는 그들의 pathogenicity에 대 한 중요 한 설정 합니다.
흥미롭게도, 그것은 또한 보였다는 mitis의 회원 그룹 S. mitis 및 H2O215,16의 생산을 통해 선 충 C. 선 충 의 죽음의 원인이 S. oralis . 이 살아있는 선 충 류는 많은 생물 학적 과정을 공부 하 간단 하 고, 유전으로 온순한 모형으로 사용 되었습니다. 더 최근에, 웜은 호스트 병원 체 상호 작용17,18연구 모델로 떠오르고 있다. 또한, 여러 연구 공부 하는이 유기 체19,20,21을 사용 하 여 산화 스트레스의 중요성을 강조 했습니다. 그것의 짧은 라이프 사이클, RNAi에 의해 관심의 최저의 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용-융합된 기자 유전자 발현을 모니터링 하는 특성을 그것에 게 매력적인 모델 시스템의 일부. 더 중요 한 것은, 산화 스트레스와 벌레에 타고 난 면역 조절 경로 높은 포유류20,22보존 됩니다.
이 프로토콜에서 그것는 연쇄 구 균 파생 된 H2O2로 인 한 pathogenicity 명료 하 C. 선 충 을 사용 하는 방법은 보여 줍니다. 수정 된 생존 분석 결과 표시 하 고 mitis 그룹의 구성원을 급속 하 게 벌레를 죽 일 수 있습니다 통해 H2O2의 생산. 반응 산소 종의 지속적인된 생물 소스 mitis 그룹의 구성원을 사용 하 여 (선생님) 제공, 벌레에 산화 스트레스를 유발 하는 화학 원본에 반대 합니다. 또한, 박테리아는 H2O2 (여러 방 벽을 교차 하 고 있는 다른 소스에 비해) 창 자 세포에 직접 타겟이 될 수 있는 벌레를 빠르게, 식민지 수 있습니다. 분석 결과 중 1)으로 skn-1 돌연변이 스트레인의 또는 2) skn-1 웜 N2 야생-타입 기준 및 벡터 제어 처리 벌레에 RNAi를 사용 하 여 아래로 노크 하 여 생존을 결정 하는 유효성이 검사 됩니다. SKN-1 C. 선 충23,,2425의 산화 스트레스 반응을 조절 하는 중요 한 전사 요소입니다. 생존 분석, 뿐만 아니라 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 기자 표현 웜 변형 mitis 그룹은 산화 긴장 응답을 통해 H2O2 의 생산의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다.
Enterococcus faecium, H2O2 에서 혐 기성 성장 생산 등 다른 병원 성 세균에 대 한 설명 하는 메서드를 사용할 수 있습니다 microaerophilic26조건 또는. 일반적으로, 대부분 병원 성 유기 체를 위한 그것은 걸립니다 몇 일 주 생존 분석 실험. 그러나, mitis 그룹의 구성원에 의해 H2O2 의 강력한 생산으로 인해 이러한 분석 5-6 h 설명 된 조건 내에서 완료 될 …
The authors have nothing to disclose.
우리 감사 박사 빙 연의 왕, 박사 장군이 Tribble (텍사스 대학, 치과의 학교), 박사 리처드 Lamont (루이스 빌 대학, 치과의 학교), 및 실험실 및 임상 긴장의 제공에 대 한 박사 사무엘 셸 번 (MD 앤더슨 암 센터) mitis streptococci 그룹. 우리는 또한 선 충 C. 긴장에 대 한 박사 키이 스 블랙 웰 (유전학의 부, 하버드의과 대학) 감사합니다. 마지막으로, 우리 감사 박사 다니엘 Garsin와 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥 거 번의과 대학) 시 약 및 연구 수행을 웜 변종. 일부 웜 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.
Media and chemicals | |||
Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
8.25% Sodium Hypochlorite | |||
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
(−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Consumables | |||
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Software | |||
Prism | Graphpad | ||
Bacterial Strains | |||
S. oralis ATCC 35037 | |||
S. mitis ATCC 49456 | |||
S. gordonii DL1 Challis | |||
E. coli OP50 | |||
E. coli HT115 | |||
Worm Strains | |||
Strain | Genotype | Transgene | Source |
N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |