Um Método Laboratorial para Medir o Bocejo Contagioso em Ratos

Tradicionalmente, o comportamento comunicatório tem sido estudado a partir de duas perspectivas. De uma perspectiva, os etologistas observam e registram o comportamento dos animais em configurações naturais e tentam reconhecer seu valor adaptativo¹. O sentido particular ou os sentidos envolvidos não foram o interesse preliminar destes estudos. De outra perspectiva, os fisiologistas estão mais interessados em desvendar os mecanismos pelos quais os animais se comunicam¹; assim, estudos laboratoriais têm proporcionado métodos para abordar o papel que as modalidades sensoriais desempenham na comunicação^2,3. Essas duas perspectivas são de fato complementares, pois o conhecimento do valor adaptativo e dos mecanismos imediatos é necessário para obter uma compreensão compreensiva dos comportamentos comunicatórios na vida social dos animais.

O comportamento de bocejo é um componente conspícuo do repertório comportamental em várias espécies de vertebrados⁴, variando de peixes a primatas⁵. Pode ser descrita como uma abertura lenta da boca e manutenção de sua posição aberta, seguida por um fechamento mais rápido da boca⁵. A duração de toda a sequência depende da espécie; por exemplo, primatas bocejam para durações mais longas do que as espécies não-primatas⁶. Em muitas espécies, sendo os seres humanos a exceção, os machos tendem a bocejar mais freqüentemente do que as fêmeas⁷. Esta característica pôde sustentam a função comunicatory possível de bocejar, embora os testes padrões regulares do bocejo e de sua freqüência diária possam igualmente sugerir uma função physiological. Em ratos, o bocejo espontâneo segue um ritmo circadiano, com picos de alta freqüência ocorrendo na manhã e tarde^8,9.

Uma característica interessante do comportamento de bocejo é que pode ser um ato contagioso (quando o estímulo liberador de um comportamento passa a ser outro animal se comportando da mesma forma¹⁰) em várias espécies de vertebrados^{11,12, 13,14,15,16}, incluindo pássaros¹⁷ e roedores¹⁸. Além disso, evidências recentes indicaram que o bocejo contagioso pode refletir um papel comunicatório, pois o bocejo de um rato pode afetar o estado fisiológico de outro quando exposto a pistas olfativas¹⁹. No entanto, se o bocejo tem ou não um papel comunicatório ainda está em debate^20,21, e analisando o bocejo contagioso é um primeiro passo essencial para resolver esta questão.

Por outro lado, o bocejo contagioso tem sido ligado à capacidade de um animal de empatia com as perspectivas de outros animais; Portanto, indivíduos estreitamente relacionados são mais propensos a mostrar contágio⁴. Esta hipótese tem sido freqüentemente testada em condições laboratoriais em que os animais são apresentados com estímulos de bocejo no vídeo^12,13; Portanto, o contágio só pode ocorrer através de pistas visuais. Outras investigações avaliaram o contágio de bocejo em condições mais naturais usando grupos de animais^14,15. Um grande problema disso é que os animais socialmente interagindo muitas vezes respondem a pistas e sinais de troca que são transmitidos através de combinações de modalidades sensoriais. Desentangling os sentidos reais envolvidos em um determinado comportamento de seus efeitos combinados nem sempre é uma tarefa fácil. Tipicamente, os pesquisadores dificultam farmacologicamente ou cirurgicamente o uso de um animal de um determinado senso, então inferem o papel desse sentido no comportamento relevante^2,3,18,22. Felizmente, existem outros métodos em que apenas barreiras físicas são usadas para permitir ou impedir a comunicação entre os animais²³,^24,25, obtendo assim maior validade biológica.

O método proposto aqui foi projetado especificamente para estudar o bocejo contagioso em ratos familiares e desconhecidos em um ambiente social. De acordo com a hipótese empática, o primeiro grupo deve ser mais suscetível ao bocejo contagioso. O método não exige que os animais sejam cirurgicamente ou farmacologicamente privados de quaisquer sentidos. Em vez disso, ele funciona colocando os ratos em gaiolas adjacentes com furos e obstruindo fisicamente sua comunicação usando divisores claros ou opacos com ou sem furos. Assim, quatro condições de teste podem ser examinadas: (1) Comunicação olfativa (OC, divisor opaco perfurado), (2) comunicação visual (VC, divisor claro não perfurado), (3) comunicação visual e olfativa (VOC, divisor claro perfurado) e (4) nem comunicação visual e olfatória (NVOC, divisor opaco não perfurado). Conseqüentemente, os investigadores podem comparar as contribuições relativas de olfactory, Visual, e até certo ponto, indicações auditivas no contágio do bocejo. Essa abordagem não é nova, pois métodos semelhantes têm sido utilizados para isolar os sentidos envolvidos em determinados comportamentos comunicatórios em animais como lagartos²³ e camundongos²⁶. Na verdade, Gallup e colegas²⁷ usaram um método semelhante para demonstrar o papel das pistas visuais no bocejo contagioso em budgerigars. As principais características destes métodos são a simulação de um contexto social e o stress mínimo infligido aos animais. Além disso, o uso de animais interagindo aumenta a validade biológica das conclusões.

Existem várias maneiras de medir o bocejo contagioso^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicação pessoal, 2015) nos ajudou a adaptar numericamente um método anteriormente empregado pelos primatólogos^13,14 para uma análise mais precoce dos dados utilizados aqui¹⁸. Apresentado neste protocolo é uma versão melhorada deste método com uma gama mais ampla de aplicações. Consiste na ponderação do número total de bocejos de um rato, dentro e fora de uma janela de tempo dada, pela proporção de tempo de observação correspondente aos bocejos dentro e fora da janela de tempo.

Por exemplo, se se supor que os ratos A e B são observados por 12 min, seu bocejo é gravado ao minuto o mais próximo, e uma janela de tempo de 3 minutos é ajustada para medir bocejo contagioso. Em seguida, as seguintes sequências de bocejos para cada um desses ratos são consideradas: Rat A (0, 0, 0, 1, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 2, 1) e Rat B (0, 1, 1, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 0,0, 3). Deve-se notar que cada número (0-3) corresponde ao número de bocejos marcados em cada minuto. Para o rato A, durante os minutos 1, 10 e 11 (números em negrito), o rato B não bocejo dentro dos 3 min precedentes (a janela de tempo escolhida) ou dentro desse minuto. Naqueles minutos, um rato bocejos um total de 2 vezes. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A sem nenhum estímulo do bocejo (taxa do bocejo do não-borne-bocejo) é 2/3 (isto é, 0,67 yawns/min). Nos 9 min restantes, o rato B boceja pelo menos uma vez no mesmo minuto ou nos 3 minutos precedentes. Rat a bocejos um total de quatro vezes naqueles 9 min. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A em resposta a um estímulo do bocejo (taxa do bocejo do borne-bocejo) é 4/9 (isto é, 0,44 yawns/min). A aplicação do mesmo procedimento para Rat B produz uma taxa de bocejo não pós-bocejo de 2/3 (i.e., 0,66) e taxa de bocejo pós-bocejo de 5/9 (0,55).

Por outro lado, se o bocejo é gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, o contágio de bocejo resultará em um tempo pós-bocejo ajustado. Por exemplo, se os seguintes tempos de bocejo forem gravados durante um período de observação de 12 min para os ratos A e B: rato A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) e Rat B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Para o rato a, os períodos de tempo sobre que o rato B não bocejo dentro da escala passada de 3 minutos de 0 a 1,2 de minuto e de 8,1 a 11,2 minutos (isto é, 3,1 minutos), que rende um total de 4,3 minutos do tempo do não-borne-bocejo. O número de vezes que um rato bocejos durante esses tempos é três (números em negrito), assim que a taxa de bocejo não-post-bocejo é 3/4.3 (ou seja, 0,69), enquanto a taxa de bocejo pós-bocejo é 3/7.7 (ou seja, 0,38; o denominador de 12-4.3 min). Similarmente, para o rato B, os períodos de tempo sobre que rato A não bocejo dentro dos 3 minutos passados variam de 0 a 2,3 minutos e de 8,8 a 10,4 minutos, que rende um total de 3,9 minutos. O número de vezes que o rato B bocejos dentro daqueles períodos é um, assim que a taxa do bocejo do não-borne-bocejo é 1/3.9 (isto é, 0,25). Consequentemente, a taxa do bocejo do borne-bocejo é 6/8.1 (isto é, 0,74).

Enquanto um fósforo próximo-contemporâneo no comportamento é um critério ideal para demonstrar a presença de um contágio, aspectos como as restrições sobre o que um indivíduo atende, tempo de reação a um estímulo, distribuição do comportamento ao longo do tempo (por exemplo, bocejo pode ocorrer em episódios), e tempo para aclimatizar ao cenário experimental todos dão origem a diferenças de espécies, dificultando a utilização de uma janela de tempo única. Esta pode ser a razão pela qual os pesquisadores usaram janelas de tempo que variam de segundos⁵ a vários minutos¹¹, o que cria problemas ao comparar os resultados²⁸. Por causa disso, propõe-se repetir o procedimento descrito acima para uma série de janelas de tempo para obter curvas de contágio de bocejo e comparar as curvas de contágio de bocejo entre as espécies.

As curvas equivalentes do contágio do bocejo podem ser comparadas distribuindo aleatòria o número de bocejos observados para cada rato sobre o período de observação. Assim, o método proposto para medir o contágio do bocejo oferece dois tipos de controles: a (1) taxa de bocejo ocorrendo fora da janela de tempo (tempo não pós-bocejo) e (2) curva de contágio de bocejo artificial obtida a partir da distribuição aleatória do número de bocejos. Portanto, essa abordagem para analisar o contágio do bocejo é um passo em frente de outros procedimentos, como aqueles que comparam a porcentagem ou frequência de bocejo dentro de uma única janela de tempo àquela que ocorre fora desta janela²⁵, sem ter em conta o quadros de tempos reais. O método é complementado por um programa baseado em R²⁹ para calcular convenientemente e objetivamente a probabilidade de bocejar contagioso para uma ou mais janelas de tempo.

Para ilustrar a utilidade deste método e das vantagens do programa baseado em R, é utilizado um conjunto de dados de um estudo publicado anteriormente¹⁸ . A condição experimental consistiu em 144 ratos machos alocados a uma condição familiar ou desconhecida. Os ratos em cada condição experimental foram subdivididos em quatro subgrupos de nove pares e expostos a qualquer uma das quatro situações de teste descritas acima. Os comportamentos de bocejo dos ratos em cada condição experimental e a situação do teste foram gravados então durante um período de 60 minutos.