Mitokondrial solunum zinciri kompleksleri kültürlü insan hücrelerinde mavi yerli Polyacrylamide Jel Elektroforez ve Immunoblotting kullanarak Analizi

spaNOTE: Bu protokolü Hilander vd.13 ile ilişkili bir yayın üzerinde dayanır. 1. hazırlanması arabellekleri ve çözümleri Not: Tüm arabellekleri ve çözümleri iletişim kuralında kullanılan Tablo 1′ de özetlenmiştir. Arabellekleri belirli miktarda hazırlamak ve 10 örnekleri çalıştırmak yeterlidir. Tüm arabellekleri 4 ° C’de bir yıl süreyle saklanır. 3 x 1.5 M aminocaproic asit, 150 mM Bis-tris distile su (dH2O) içeren jel arabellek 20 mL hazırlayın. PH 7,0 için ayarlayın. 2 M aminocaproic asit dH2O. 10 mL hazırlamak 1 mL mitokondrial arabelleği aşağıdakileri birleştirerek hazırlamak: 3 x jel arabellek, 2 M aminocaproic asit 0.5 mL ve 500 mm EDTA 4 µL 0.5 mL. 15 mM Bis-tris ve tricine dH2O. ayarlama pH 7. 0, 50 mM içeren katot arabelleği 1000 mL hazırlayın. 200 mL mavi katot arabelleği katot arabellek için 200 mL Coomassie mavi G-250 0,04 g ekleyerek hazırlayın. 1000 mL 50 mM Bis-tris dH2O. ayarlama pH 7. 0’deki içeren anot arabelleği hazırlayın. 750 mM aminocaproic asit ve % 5 Coomassie mavi içeren örnek arabelleği 2.5 mL hazırlamak dH2O. G-250 2. mitokondriyal lysates hazırlanması Hücreleri koleksiyonu önceki gün plaka. HEK293 veya 143B hücreler için kullanım Dulbecco’nın % 10 fetal Sığır serum, 1 L-glutamine, 100 mg/mL penisilin ve % 100 mg/mL streptomisin ile kartal Orta (DMEM) değiştiren. Bir hücre kültür kuluçka 37 derece ° c % 5 CO2 oksijen atmosferde hücrelerin büyümesine. Koleksiyon günde en az 500.000 hücreler her örnek için olduğundan emin olun. Yavaşça hücreler buz gibi PBS ile yıkayın. Plaka hücrelerden ayırma kaçının. Hücreleri scrape ve onları vasıl 800 x g 4 ° C’de 10 dakika için cips Hücre Pelet buz gibi PBS ile iki kez yıkama ve adım 2.2 olduğu gibi santrifüj kapasitesi. Protein konsantrasyonu ticari bir seti kullanarak Bradford yöntemiyle ölçmek. Hücreleri 800 x g 4 ° C’de 10 dakika için de cipsNot: Hücre toplama sonra 4 ° C’de tüm adımlarını gerçekleştirin ve değil girdap yapmak. PBS 20 mL proteaz inhibitörü ile PBS için 20 mL 100 x proteaz inhibitörü 200 µL ekleyerek hazırlayın. Buz üstünde tutun. PBS hücrelerde proteaz inhibitörü olarak 5 mg/mL son protein konsantrasyonu ile resuspend. Senaryo Özeti 5 mg/mL resuspend için gerekli proteaz inhibitörü ile PBS hacmi hesaplamak için her örnek protein tutarı hesaplamak. Bu hesaplama için adım 2.3 ve PBS hücreleri adım 2.3 yıkama sonrası resuspend için kullanılan birim cinsinden protein konsantrasyonu kullanın. PBS içinde 3,3 mM digitonin proteaz inhibitörü ile 1 mL hazırlayın. 3.3 mM digitonin 1.65 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. Mix iyi ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya. PBS içinde 3,3 mM digitonin proteaz inhibitörü ile 1 mL hazırlamak için hiçbir çökelti buza hemen görünür ve serin kadar PBS 1 ml 100 ° C’de digitonin 4 mg geçiyoruz. 100 x proteaz inhibitörü 10 µL 1 mL digitonin çözeltisi ekleyin.Not: sadece digitonin taze bir çözüm kullanın.Dikkat: Digitonin zehirlidir! Bir yüz maskesi, eldiven ve önlük kullanın. PBS İndinavir inhibitörü (2.4 adımda hazırlanan) 1,5 mL son hacim için ekleyin. 10.000 x g, santrifüj 10 min için + 4 ° c Süpernatant kaldırın. Bu adımda, mitokondri pelleted. Mitokondrial Pelet mitokondrial arabellekte resuspend. Mitokondrial arabelleği PBS birimin adım 2.4 birimdir. Proteaz inhibitörü (2.4 adımda hazırlanan) içeren PBS taze % 10 loril maltoside hazırlayın. 1 mL 10 örnekler için yeterlidir. % 10 loril maltoside için % 1’lik konsantrasyon son ekleyin. (Bu adım-ebilmek var olmak birkaç saat kadar daha uzun) 15dk için buz üzerinde kuluçkaya. 20.000 x g , santrifüj 20 dk + 4 ° c Süpernatant yeni bir tüp içine toplamak. Protein konsantrasyonu bir seti kullanarak Bradford yöntemle ölçmek. Örnek arabellek, loril maltoside 2.8 adımda kullanılan birimin bir birimi ekleyin. Örnekleri-80 ° C’de 6 aya kadar muhafaza edilebilir. 3. BN-sayfa için degrade jel hazırlanması Degrade jel BN-sayfa için oda sıcaklığında dökün. Degrade makinesi bir heyecan tabağa yerleştirin ve esnek boru peristaltik pompa ile bağlayın. İğne ile tüp için ayarla bir infüzyon iliştirin. Manyetik karıştırıcı degrade makinesi proksimal odanın içine yerleştirin. 10 dk için maksimum pompa hızda boru dH2O ile yıkayın. Boş tüp ve degrade makinesi. Bir damlalıklı degrade maker’ın odaları arasında kanal herhangi bir artık dH2O kaldırmak için kullanın. Kanal ve boru vana ile kapatın. Döküm çerçeve ve kelepçeler kullanılarak iki cam tabak altındaki bir delik vardır, tutucu, montajı ve kürsüye yerleştirin. Bu daha fazla veya daha az su dengesi ile düz bir yüzey üzerinde olduğundan emin olun. Yer iğne tüp cam plakanın arasında bağlı. %6 ve jel çözümleri (Tablo 2) hazırlayın. Buz üstünde tutun. Amonyum Persülfat (APS) ve tetramethylenediamine (TEMED) (başlıyorlar polimerizasyon) eklemek son. Yavaşça hava önüne geçmek için Mix kabarcıklar. Degrade-jel-Mikser boru Odası % 6 jel ile proksimal sonuna ve % 15 jel distal ucu yük. Jel hacmi cam plakanın arasında ayıran jel hacmi eşit olması gerekir. Böylece, 2.6 mL % 6 jel ve 2.1 mL % 15 jel degrade jel Mixer bir 8.3 cm x 7,3 büyüklüğünde cm jel için kullanın. Manyetik karıştırıcı geçin ve boru ve degrade maker’ın odaları arasında bir kanal açın. Hemen 5 mL/dk. peristaltik pompa geçiş cam plakanın doldurun ve kabarcıklar jel girmek için izin vermez. Tüp yok jel iğneyi çıkarın. Yavaşça dH2O. tutmak için en az 1 h polimerizasyon için oda sıcaklığında jel ile jel kaplama. Hemen jel dökme sonra yıkama tüp degrade chambers dH2ile O doldurma ve maksimum hızda peristaltik pompa kullanarak. İki ve daha fazla jelleri hazırlanırken, her zaman temiz belgili tanımlık sistem arasında. 3 x jel arabellek 3 mL karıştırarak 1 x jel arabellek hazırlamak ve dH2O. Kaldır dH2O 6 mL jel filtre kağıdı ile yüzeyinden yavaşça ekleyin. Jel 1 x jel tampon ile yüzey yıkamak. 1 x jel arabellek filtre kağıdı ile yavaşça çıkarın. Jel filtre kağıdına lifleri kaçının. Bunu sağlamak için kağıt küçük parçalara makasla kes ama kağıt gözyaşı değil. Tarak cam plaka arasındaki yeri, ama bu tamamen tarak altında yığın jel dökmek edebilmek için sokmak değil. Jel (Tablo 2) istifleme %4 hazırlayın. APS ve TEMED eklemek son polimerizasyon kolayca Başlarken. Yavaşça kaçınarak hava kabarcıkları karıştırın. Tarak koltuğunuza uzanın ve kabarcıklar tarak altında kaçınarak yığın jel kaplama. Let yığın jel polimerize için en az 30 dk tarak kaldırın ve wells ile 1 x jel arabelleği bir damlalıklı kullanarak yıkayın. Polimerizasyon sonra jel 4 ° C’de birkaç gün saklanabilir. Jel depolamak için dH2O ve plastik ile batırılmış kağıt jel şal jel kurutma önlemek için film. 4. mavi yerli Jel Elektroforez Not: OXPHOS bozulma önlemek için kompleksleri Elektroforez 4 ° C’de çalıştırın Önceden soğutulmuş arabelleklerini kullan. Mavi katot arabelleği ile jel kaset kuyu dibine kadar yük. Kaset dön doldurulmamış örnekleri yükleme kolaydır. Mavi katot arabellek Wells’le yıkama ve sonra kuyu mavi katot arabelleği damlalıklı kullanarak doldurun. Örnekleri (5-30 µg protein) kuyu yükleyin. Yavaşça jel kaset üst mavi katot tampon ve anot arabellek ile tank ile doldurun. 15dk için jel 40 V sabit bir gerilim çalıştırın. 80 V voltajı yükseltin (veya 6 sabit bir geçerli olanı kullan mA), 10 aşmamak anne. Jel Boya 2/3 jel uzunlukta ulaşıncaya kadar çalıştırın. Mavi katot arabellek katot arabellek ile değiştirin ve boya açık tükendi kadar Elektroforez devam edin. Toplamda, Elektroforez yaklaşık 3 saat sürer. Cam plakanın almak ve yarı kuru Blot tarafından polivinilidin florid (PVDF) membran proteinleri aktarın. Bir 30 dk için 1,0 için sınırlı bir akım ve 25 V sabit voltaj kullanın. Alternatif olarak, ıslak kurutma OXPHOS kompleksleri PVDF membran için aktarmak için kullanın. Standart immunoblotting protokolüne göre membran ve antikor kuluçka engelleme ile devam edin. OXPHOS kompleksleri altbirimden karşı birincil antikor sırayla kullanın.Not: Örneğin, anti-NDUFA9 antikor (1:2000) için karmaşık kullanın. ben anti-SDHA antikor (1:2000) karmaşık II, anti-UQCRC2 antikor (1: 1000) karmaşık III, anti-COX1 antikor (1:2000) karmaşık IV ve anti-ATP5A antikor (1:2000) karmaşık V için için için için. Antikorlar listesi Tablo reçetesisunulur.