מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

הערה: איור 1A, B מציג סכמטי של שבב ה-coc המורכב מראש, כולל המיקומים של הערוצים הראשיים או התאים, הבארות והמיקרוחריצים. השבב מידור יכול להקים מיקרופיאידים ברורים בתוך תא כמו להפגין על ידי בידוד של צבע צביעה מזון (איור 1C). הפרוטוקול להכנת השבב הרב-ממדי של ההרכבה מראש מוענק בנגנדרן ואח ‘, סעיף12. 1. ציפוי שבבי מרובת-תאים עבור hSC-נוירונים הערה: איור 2A מציג מבט כולל על הליכי הציפוי. התמוססות פולי-L-אורתך במים מזוקקים כיתה התרבות כיתה כדי להפוך את 600 μL של פתרון לכל שבב של 20 μg/mL פתרון העבודה. . אחרי שהכין את האסימונים מבארות כאשר אתה מורח, לוודא את העצה הפייפט הוא הרחק מפתח הערוץ.הערה: הערוצים המיקרופלואידים חייבים להישאר מלאים למשך כל הליך זה. אין לאכול נוזלים מן הערוצים/התאים, רק את הבארות. טעינת 150 μL של הפתרון העובד של פולי-L – אוראתה בחלק הימני העליון של הבאר. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של מדיה לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור דרך מיקרוחריצים. הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. עוטפים את מחזיק השבבים עם parafilm ומניחים ב -4 ° c בלילה.הערה: לחלופין, הניחו את השבב והמחזיק ב-37 ° c עבור 1 h. מוריד את המדיה מבארות, ומוודא שהקצה הפתוח של הערוץ ממוקם הרחק מפתח התעלה. הוסף 150 μL של מים עקרים לימין הימני העליון. המתן 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לנוזל לעבור את המיקרוחריצים. הוסף 150 μL של מים סטרילי לפינה השמאלית העליונה, לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף עוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה. חזור על שלבים 1.5-1.6. הפשרת למינציה באיטיות ב-2 ° צ’ עד 8 ° צ’ והכינו פתרון עבודה של 10 μg/mL. טען 150 μL של המילמינציה בפתרון העבודה לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. Pipet 150 μL למטה בסדר גמור. המתן 5 דקות כדי לאפשר למילמינציה לעבור את המיקרוחריצים. הוסף 150 μL של למינציה לפינה השמאלית העליונה. לחכות 90 s ולאחר מכן להוסיף 150 μL לימין השמאלי התחתון. מודקת את השבב בתוך המחזיק שלה 2 h ב 37 ° c. לשטוף את השבב עם PBS (ללא Ca2 + ו-Mg2 +). טעינת 150 μL של PBS לימין הימני העליון. המתן 90 s או עד הנוזל מתחיל למלא את הטוב הימנית התחתונה. הוסף 150 μL של PBS לימין הימני התחתון והמתן 5 דקות כדי לאפשר ל-PBS לעבור את המיקרוחריצים. Pipet 150 μL של PBS למעלה השמאלית העליונה. אחרי 90 s pipet 150 μL לשמאל היטב שמאל. ולאחר מכן לשטוף את השבב עם מדיה המועצה לבטחון לאומי (ראה לוח חומרים). טען 150 μL של מדיה לימין הימני העליון. אחרי 90 s או כאשר הנוזל עובר דרך הערוץ הימני לתוך הטוב הימנית התחתונה, להוסיף 150 μL לימין הימני התחתון. המתן 5 דקות כדי לאפשר לתקשורת לזרום דרך המיקרוחריצים. הוסף 150 μL של מדיה לפינה השמאלית העליונה ועוד 150 μL לפינה השמאלית התחתונה. מודטה את השבב בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי לקדם תנאי השבב עד מוכן seed NSCs.הערה: ניתן לעשות שבבים ממוזגים ללילה במידת הצורך. 2. זריעת NSCs לתוך השבב הרב הערה: פרוטוקול זה השתמש NSCs מסחרית רכשה, בניגוד לפרסום הקודם שלנו אשר החלה עם תאים מעובריים אנושיים5. בפרוטוקול זה בתאי גזע עצביים מצופים ישירות לתוך שבבי פלסטיק שבו הם להבדיל לנוירונים. התאים יכולים להיות מותר להתרבות כמו NSCs (ללא בידול) עבור עד 2 מעברים ומאוחסן בבקבוקונים N נוזלי2 לשימוש נוסף. פרוטוקול זה משתמש בבקבוקונים של המועצה לבטחון לאומי המאוחסנים ב-N הנוזל2 לאחר מעבר 1 או 2. איור 2B מציג סקירה של הליכי הציפוי. הפשרת NSCs על פי הוראות היצרן.הערה: הליך זה חל על NSCs H9 נגזר. קווי תאים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות תאים. לספור את ריכוז התא באמצעות הומוציטוטומטר ולהתאים באמצעות מדיה לבטחון לאומי כדי לקבל ריכוז של 7 x 106 תאים לכל mL. מחלק מדיה מכל. חלק בשבב הימנע מלאחד מדיות מהערוצים המרכזיים. Pipet 5 μL של פתרון התא לימין הימני העליון, ואחריו 5 μL לימין התחתון טוב (70,000 הכולל תאים). ודא שהתאים מתצינורות לעבר פתחי הערוץ הראשי. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ. לחכות 5 דקות לתאים לדבוק בחלק התחתון של השבב.הערה: ניתן להשתמש בשני התאים או בשניהם כדי לטעון תאים. Pipet ~ 150 μL של מדיה לבטחון לאומי לימין הימני העליון ולאחר מכן 150 μL לימין הימני התחתון. . חזור על הצד השמאלי דגירה ב 5% CO2, 37 ° c בתוך מיכל לחות מתאים מחולל. לאחר 48 שעות, מחלק את התקשורת המועצה לבטחון לאומי מן הבארות ולהחליף עם התקשורת בידול עצבי על ידי הוספת 150 μL לכל הטוב בראש כל היטב בתחתית. תרבות נוירונים ברדיוס של 5% CO2, 37 מעלות בחממה בתוך מיכל לחות מתאים.הערה: יש להחליף את המדיה כל 2-3 ימים. בגלל הכרכים הקטנים המשמשים את השבב, אידוי גם בתוך החממה מחולל לחות יכול להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות התא. השתמשו במיכל משני מתאים כדי לספק לחות נוספת לתרבות ארוכת טווח של תאים עם השבב (ראו טבלת חומרים). 3. ויראלי תיוג פלורסנט של hSC-נוירונים בתוך השבב הערה: וירוס מרובים ניתן להשתמש כדי לתייג נוירונים בתוך השבב. הוראות שלהלן מתארות את השימוש ב-G-כלבת-מדובדבן או בווירוס-eGFP. חומרים מדבקים העלולים להיות מטופלים על פי הכללים והתקנות הישימים, ועשויים לדרוש הכשרה נוספת ואישור מוסדי. חם ~ 400 μL של מדיה בידול עצבי חדש לכל שבב ל 37 ° c. הסר 50 μl של מדיה מבאר אחת של תא אקסון לתוך שפופרת צנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף 100,000 יחידות ויראליות של וירוס כלבת שונה לצינור.הערה: כראוי להיפטר בילה טיפים pipet וצינורות צנטריפוגה המכיל וירוס. הסירו את מדיית הבידול העצבית הנותרת מהתא האקונאלי והניחו לצינור הצנטריפוגה. חנות ב37 ° c.הערה: ודא שהערוצים נותרים מלאים בנוזל. מערבבים את 50 μL של פתרון וירוס עם 150 μL של מדיה מחומם. Pipet 100 μl אחד היטב של תא אקסון ו 100 μl אל האקסון השני היטב. המשך 2 שעות בתוך החממה 37 ° c.הערה: ההבדל באמצעי האחסון בין התאים האקונאליות ובתאי הסומטיים מסייע להבטיח שהוירוס יישאר בתא האקונאליות בזמן הידבקות/דגירה. נסיגה והיפטר ממדיה המכילה וירוסים.התראה: אין להסיר נוזלים בתוך ערוצי המיקרו-פלואידים הסגורים. בעדינות pipet 75 μl של מדיה טרייה אחד אקסון תא היטב ולתת את זרימת התקשורת דרך הערוץ לתוך אקסון אחרים היטב. הסר מדיה מהתא אקסון והיפטר כראוי. חזור על שלבים 3.6 ו-3.7. מלא את תא ה-אקסון במדיה השמורה. Pipet נוסף 50 μL מדיה טרייה, במידת הצורך, ולאחר מכן להחזיר את השבב לחממה. מדיה חדשה נוספת היא לספור לקראת אובדן התקשורת במהלך העברה נוזלית והתאיידות במהלך התהליך.הערה: תיוג פלורסנט גלוי באמצעות אלה וירוסים ששונו כלבת מתרחשת על ידי 48 h ועד 8 ימים לאחר איזה תא מוות של נוירונים נגועים בדרך כלל מתרחשת עקב רעילות וירוסים. הדמיה תא העצב ניתן לבצע כמו בפלטפורמות אחרות התרבות הסטנדרטית (למשל, זכוכית מנות בתחתית), אבל שיקול מיוחד נדרש כדי לשמור על לחות מספקת כדי למנוע הפסדים התטיבי. 4. בידוד פלואידיק, פיום וכתמים בתוך השבב עקוב אחר בידוד פלואידיק, הפיום והמעבד החיסוני עם השבב כפי שמתואר בניונדרזו ואח ’12.