预组装塑料微流体芯片中人类干细胞衍生神经元的分段化

注:图1A,B显示了预组装的COC芯片的示意图,包括主通道或隔间、井和微槽的位置。分离芯片可以在隔间内建立独特的流体微环境,食品着色染料的分离证明了这一点(图1C)。Nagendran等人给出了制备预组装多腔室芯片的协议,第1节第12节。 1. hSC-神经元多腔芯片的涂层 注:图2A显示了涂装程序的概述。 在细胞培养级蒸馏水中溶解聚L-球基,使20μg/mL工作溶液的芯片上产生600μL的溶液。 在准备油井的芯片后,吸出剩余的PBS。吸气时,确保移液头远离通道开口。注: 在整个此过程过程中,微流体通道必须保持填充。不要从通道/隔间吸出液体,只有井。 在右上角井中加载 150 μL 的多L-金属质溶液。等待 90 s 或直到液体开始填充右下角的井。将 150 μL 的介质添加到右下角,等待 5 分钟,让液体通过微槽。 将 150 μL 的介质添加到左上角井。等待 90 s,然后将 150 μL 添加到左下井。用副膜包裹芯片支架,并在4°C处过夜。注:或者,将芯片和支架置于 37°C 1 小时。 从井中吸出介质,确保移液器尖端远离通道开口。在右上方井中加入150 μL无菌水。等待 90 s,然后将 150 μL 添加到右下角。等待 5 分钟,让液体通过微槽。 向左上井添加150 μL无菌水,等待90s,然后将另外150μL添加到左下井。 重复步骤 1.5-1.6。 在2°C至8°C下缓慢解冻层压,并准备10μg/mL工作溶液。 将150 μL的层压工作溶液加载到右上方井。等待 90 s 或直到液体开始填充右下角的井。移液 150 μL 到右下角井。等待 5 分钟,让层宁穿过微槽。 在左上部井中加入150 μL的层宁。等待 90 s,然后将 150 μL 添加到左下井。在37°C下孵育芯片支架2小时。 用 PBS 冲洗芯片(不含 Ca2+和 Mg2+)。将 150 μL 的 PBS 加载到右上角的井上。等待 90 s 或直到液体开始填充右下角的井。将 150 μL 的 PBS 添加到右下角的井中,等待 5 分钟,让 PBS 穿过微槽。 将 PBS 的 150 μL 移至左上井。90s 移液后 150 μL 到左下井。 从芯片中吸出PBS,然后用NSC介质冲洗芯片(见材料表)。将 150 μL 的介质加载到右上角的井上。90 s 后或液体通过右下通道进入右下角井时,向右下角井添加 150 μL。等待 5 分钟,让介质流过微槽。 向左上井添加 150 μL 的介质,向左下井添加 150 μL 的介质。在 37°C 的培养箱中孵育芯片,其中 5% CO2可预置芯片,直到准备好播种 NSC。注:如果需要,芯片可以隔夜预调节。 2. 将 NSC 播种到多隔间芯片中 注:该协议使用商业购买的NSCs,不像我们以前出版的出版物,开始于人类胚胎干细胞5。在这个协议中,神经干细胞被直接镀入塑料芯片中,在那里它们分化成神经元。细胞可以增殖作为NSCs(无差别)多达2个通道,并存储在液体N2的瓶中供进一步使用。 该协议使用在通道 1 或 2 之后存储在液体 N2中的 NSC 小瓶。图 2B显示了涂装程序的概述。 根据制造商的说明解冻 NSC。注: 此过程适用于 H9 派生的 NSC。其他细胞系需要细胞密度优化。 使用血细胞计计算细胞浓度,并使用 NSC 介质进行调整,以获得每 mL 7 x 106细胞的浓度。 从芯片的每个井中吸出介质。避免从主通道吸气介质。 将5μL的细胞溶液移至右上井,后至右下井5μL(共70,000个细胞)。确保电池移向主通道开口。使用显微镜检查细胞已进入通道。等待 5 分钟,让细胞粘附在芯片底部。注: 任一或两个隔间可用于称重传感器。 移液 +150 μL 的 NSC 介质到右上角的井,然后 150 μL 到右下角井。在左侧重复上述步骤。在合适的加湿容器内孵育5%CO 2,37°C。 48小时后,从井中吸出NSC介质,并在每个顶部井和每个底井中加入150μL,用神经分化介质替换。 培养神经元在5%CO 2,37°C培养箱内一个合适的加湿容器内。注:介质应每 2-3 天更换一次。由于芯片中使用的体积小,即使在加湿培养箱内的蒸发也会对细胞的生存能力产生重大影响。使用合适的二次容器为芯片细胞的长期培养提供额外的湿度(参见材料表)。 3. 芯片内hSC神经元的病毒荧光标记 注:多种病毒可用于标记芯片内的神经元。以下说明描述了 G-删除狂犬病-mCherry 或 @eGFP 病毒的使用。可能感染性的材料必须按照适用的规则和条例进行处理,并且可能需要额外的培训和机构批准。 将每个芯片的新鲜神经分化介质加热 ±400 μL 至 37°C。 将50μL的介质从斧车厢的一个井中取出到离心管中,然后将100,000个经过改良的狂犬病病毒的病毒单位添加到管中。注:妥善处理含有病毒的废移液器尖端和离心管。 从斧室中取出剩余的神经分化介质,并放入离心管中。储存在37°C。注:确保通道仍充满液体。 将 50 μL 的病毒溶液与 150 μL 的加热介质混合。将 100 μL 移至安克斯子仓的一个井,将 100 μL 移至另一个安克斯子仓井。在37°C培养箱内孵育2小时。注:斧状和体细胞间之间的体积差异有助于确保病毒在感染/孵育期间停留在斧室中。 提取并处置包含病毒的介质。注意:请勿去除封闭微流体通道内的液体。 轻轻将 75 μL 的新鲜介质移至一个安克斯子仓井,让介质通过通道流入其他安克斯井。 从斧子隔间中取出介质并正确处置。 重复步骤 3.6 和 3.7。 用保存的介质填充斧子隔间。如果需要,再管一个50μL的新鲜介质,然后将芯片返回到孵化器。这种额外的新介质将计入液体转移和过程中蒸发过程中的介质损失。注:使用这些改良狂犬病病毒的可见荧光标记在48小时和8天内发生,此后受感染神经元的细胞死亡通常由于病毒毒性而发生。神经元成像可以像其他标准培养平台(例如玻璃底盘)一样进行,但需要特别考虑,以保持足够的湿度,以防止蒸发损失。 4. 芯片内的流体隔离、异形和免疫染色 按照Nagendran等人12所述的芯片进行流体隔离、异形和免疫染色。