Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo
Summary
Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell’unità neurovascolare durante l’encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato – encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.
Abstract
L’unità neurovascolare (NVU) è composto da cellule endoteliali microvascolari formando l’emato – encefalica (BBB), una membrana basale endoteliale con periciti incorporati, e la limitans glia composto da membrana dello scantinato parenchimatica e astrocitari alimentazione di testata che abbracciano l’aspetto abluminale di microvasi del sistema nervoso centrale (SNC). Oltre a mantenere CNS omeostasi il NVU controlla delle cellule immuni traffico nello SNC. Durante immunosorveglianza dello SNC basso numero di linfociti attivati può attraversare la barriera endoteliale senza causare BBB disfunzione o malattia clinica. Al contrario, durante la neuroinfiammazione come nella sclerosi multipla o il modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) un gran numero di cellule del sistema immunitario può attraversare la BBB e, successivamente, la glia limitans raggiungendo alla fine il parenchima di CNS che conducono alla malattia clinica. Migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS è dunque un processo in due fasi che comporta una migrazione sequenza attraverso la barriera endoteliale e gliale di NVU che impiegano meccanismi molecolari distinti. Se dopo il loro passaggio attraverso la barriera endoteliale, cellule T incontrano loro antigene cognate su cellule presentanti l’antigene perivascolare loro riattivazione locale avvierà successivi meccanismi che portano all’attivazione focale della gelatinasi, che consentirà le cellule di T di attraversare la barriera glial e immettere il parenchima di CNS. Così, valutazione, permeabilità BBB e attività MMP in correlazione spaziale per accumulo di cellule immuni nel SNC durante EAE permette di specificare perdita di integrità delle barriere endoteliali e gliali la nvu. Mostriamo qui come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva e come analizzare successivamente permeabilità BBB in vivo usando una combinazione di traccianti fluorescenti esogeni. Più ulteriormente indichiamo, come visualizzare e localizzare attività della gelatinasi nei cervelli EAE in situ zymogaphy accoppiato al immunofluorescente stainings di membrane dello scantinato BBB e CD45 + cellule immunitarie invasori.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) coordina tutto il corpo e funzioni mentali nei vertebrati, e l’omeostasi del CNS è essenziale per una corretta comunicazione dei neuroni. Omeostasi del CNS è garantito dall’unità neurovascolare (NVU), che protegge il sistema nervoso centrale da milieu cambiamento del flusso sanguigno. Il NVU è composto di cellule endoteliali microvascolari CNS, che sono biochimicamente unici e stabilire l’emato – encefalica (BBB) continuo crosstalk con periciti, astrociti, neuroni e componenti della matrice extracellulare (ECM), che istituisce due distinta delle membrane dello scantinato1. La membrana basale endoteliale che ensheathes l’aspetto abluminale delle cellule endothelial BBB ospita un elevato numero di periciti e si compone di laminina α4 e laminin α5, oltre ad altre proteine ECM2. Al contrario, la membrana basale parenchimatica consiste di laminina α1 e α2 laminina ed è abbracciata dai puntali astrocytic. La membrana basale parenchimatica insieme con i puntali Astrocita compone il limitans glia che segrega la rete neuronale CNS dal liquido cerebrospinale riempito perivascolare o spazi subaracnoidei3. Dovuto l’architettura unica del NVU, delle cellule immuni traffico nello SNC sono distinta da che nei tessuti periferici come richiede un processo in due fasi con le cellule immunitarie, violazione prima endothelial BBB e successivamente il limitans glia al fine di raggiungere il parenchima di CNS.
Sclerosi multipla (SM) è una malattia comune neuroinfiammatorie dello SNC, in cui un gran numero di cellule immuni circolanti immettere il CNS e causare neuroinfiammazione, demielinizzazione e perdita focale di BBB integrità4. Perdita di integrità BBB è un precoce segno distintivo della MS, come indicato dalla presenza di contrasto gadolinio aumentando le lesioni del SNC come visualizzati da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)5. Diapedesi nello SNC avviene a livello delle venule post-capillari; Tuttavia, i meccanismi precisi coinvolti nel processo di diapedesi delle cellule immuni attraverso la membrana dello scantinato BBB e successivamente la barriera glial rimangono per essere esplorato. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) serve come modello animale per MS e ha contribuito in modo significativo alla nostra attuale conoscenza sulla patogenesi della SM. Per esempio, utilizzando il modello di EAE è stato scoperto che lo stravaso del leucocita si verifica in un processo a più fasi, tra cui un’acquisizione iniziale e rotolamento passaggio mediato da selectine e mucina-come molecole come ligando di glicoproteina P-selectina (PSGL) -1, seguita da arresto ferma integrina-dipendente e scansione di cellule T su cellule endoteliali BBB ai lati permissivi per diapedesi6.
Una volta che le cellule di T hanno attraversato il BBB endoteliale e la membrana basale endoteliale, hanno bisogno di incontrare il loro antigene cognate su macrofagi o cellule dendritiche strategicamente localizzate negli spazi leptomeningeal o perivascolare. Questa interazione induce focale produzione di mediatori pro-infiammatori che attivano i meccanismi successivi necessari per invasione del tessuto CNS di cellule del sistema immunitario tramite il glia limitans7,8,9. Attivazione focale di metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9 altera l’attivazione delle chemochine e induce la degradazione dei recettori di matrice extracellulare Astrocita fine-piedi, che è un prerequisito per immunitario cellulare migrazione attraverso il limitans glia nella Parenchima di CNS e per indurre l’insorgenza di sintomi clinici di EAE10,11.
La combinazione di rilevamento del sistema nervoso centrale di infiltrazione delle cellule immuni con BBB perdite e gelatinasi attività in sezioni di tessuto di CNS fornisce preziose informazioni circa l’integrità funzionale della barriera endoteliale e gliale nel contesto del neuroinflammation. Per esempio, abbiamo recentemente studiato la perdita costitutiva della molecola di adesione giunzionale del molecola endoteliale stretta della giunzione (marmellata)-B delle cellule immuni traffico nello SNC nel contesto di EAE. Non rispetto ai topi C57BL/6 di selvaggio-tipo sani, sani littermates JAM-B-carente ha mostrato alcuna compromissione dell’integrità BBB come mostrato dalla valutazione di permeabilità in vivo mediante traccianti endogeni come pure esogeno12. Nel contesto di EAE, topi C57BL/6 JAM-B-carente ha mostrato sintomi di malattia migliorata, che è stato associato con intrappolamento delle cellule infiammatorie negli spazi leptomeningeal e perivascolare12. Per esaminare questo fenomeno abbiamo applicato in situ zymography, che consenta l’identificazione dell’attività della gelatinasi al fine di verificare se la mancanza di attività della gelatinasi in topi carenti-marmellata-B può essere responsabile per la riduzione del numero di cellule del sistema immunitario in grado di violare il glia limitans12.
Data la disponibilità di diversi geneticamente modificati del mouse modelli manca, ad esempio, diverse molecole di giunzione stretta BBB che potrebbero causare cambiamenti nella funzione BBB, metodologie per l’analisi di integrità BBB sono importanti. Inoltre, recentemente sviluppati farmaci potrebbero influire sugli ostacoli NVU. Qui vi mostriamo come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva con la glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG)-peptide aa35-55 a coadiuvanti di Freund completo. Spieghiamo quindi come localizzare l’infiltrazione delle cellule immuni attraverso le barriere endoteliali e gliali la NVU e come studiare l’integrità della barriera endoteliale e gliali in vivo di rilevazione in situ di traccianti esogeni e attività della gelatinasi, rispettivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per indurre e monitorare EAE in topi femminili C57BL/6. Le femmine sono preferenzialmente scelti, e c’è un’incidenza delle donne: gli uomini di 3:1 in MS. Per valutare la severità di EAE, abbiamo fatto uso di un foglio di Punteggio 3 punti. Gravità EAE è generalmente segnato per quanto riguarda la gravità delle disfunzioni motore. Topi con fasi avanzate di EAE, vale a dire che esibiscono un punteggio superiore a 2 dovrebbe essere sacrificata per evitare inutili sofferenze degli animali…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine Lydia Sorokin, che ha condiviso il suo originale in situ zymography protocollo10 con noi.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
Referencias
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