कैनोहैबडाइटिस एलिगेंस में डोपामाइन सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए तैराकी प्रेरित पक्षाघात
Summary
तैराकी प्रेरित पक्षाघात (swip) एक अच्छी तरह से स्थापित व्यवहार परख को caenorहैबडाइटिस एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में डोपामाइन संकेतन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन किया जाता है । हालांकि, परख करने के लिए एक विस्तृत विधि की कमी है । यहां, हम SWIP के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तैराकी परख एक वैध उपकरण है जो डोपाइन्जिक्यूटिव synapses को विनियमित करने वाले प्रोटीन की पहचान करता है । स्तनधारियों के समान, डोपामाइन (डीए) लर्निंग और मोटर गतिविधि सहित सी. एलिगेंस में कई कार्यों को नियंत्रित करता है । शर्तों कि दा रिलीज को उत्तेजित (जैसे, एंफ़ैमाइन (AMPH) उपचार) या कि डीए की मंजूरी को रोकने (जैसे, पशु दा ट्रांसपोर्टर (dat-1) जो ंयूरॉंस में डीए reaccumulating के असमर्थ है कमी) extracellular दा की एक अतिरिक्त उत्पंन अन्ततोगत्वा चलन में बाधा उत्पन्न होती है । पशुओं के पानी में तैरने पर यह व्यवहार विशेष रूप से स्पष्ट होता है । वास्तव में, जबकि जंगली प्रकार के जानवरों के लिए एक विस्तारित अवधि के लिए तैरना जारी, dat-1 नल ंयूटेंट और जंगली प्रकार amph या दा ट्रांसपोर्टर के inhibitors के साथ इलाज के नीचे अच्छी तरह से और कदम नहीं है । इस व्यवहार को “तैराकी प्रेरित पक्षाघात” (SWIP) कहा जाता है । हालांकि SWIP परख अच्छी तरह से स्थापित है, विधि का एक विस्तृत वर्णन की कमी है । यहाँ, हम SWIP प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड का वर्णन. परख करने के लिए, देर लार्वा स्टेज-4 जानवरों के साथ या बिना amph के नियंत्रण सुक्रोज समाधान युक्त एक गिलास हाजिर थाली में रखा जाता है । जानवरों को अपने स्विमिंग व्यवहार के लिए या तो मैन्युअल रूप से एक त्रिविमदर्शी के तहत या स्वचालित रूप से एक कैमरा के साथ रिकॉर्डिंग द्वारा त्रिविमदर्शी पर घुड़सवार द्वारा बनाए गए हैं । वीडियो तो एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर है, जो गर्मी नक्शे के रूप में आवृत्ति और पक्षाघात की पिटाई की एक दृश्य प्रतिनिधित्व पैदावार का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । मैनुअल और स्वचालित प्रणाली दोनों ही पशुओं के तैरने की क्षमता का आसानी से आकलन करने की गारंटी देते हैं और इस प्रकार डोपनेनरजिक प्रणाली के भीतर या सहायक जीन के लिए पशुओं के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करते हैं । इसके अलावा, SWIP का उपयोग AMPH जैसे दुर्व्यवहार की दवाओं की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है ।
Introduction
पशु सहज और जटिल व्यवहार है कि विभिंन जटिल संकेतन प्रक्रियाओं द्वारा समंवित न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा मध्यस्थता कर रहे है की एक किस्म प्रदर्शन करते हैं । न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन (डीए) सीखने, मोटर समारोह और इनाम प्रसंस्करण सहित प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित व्यवहार मध्यस्थता करता.
मिट्टी सूत्रकृमि C. एलिगेंस, एक अपेक्षाकृत सरल और अच्छी तरह से मैप तंत्रिका प्रणाली के साथ केवल ३०२ ंयूरॉंस से मिलकर, स्पष्ट रूप से जटिल व्यवहार से पता चलता है, सहित कई कि डीए द्वारा विनियमित जैसे सहवास, सीखने, foraging, चलन और अंडा बिछाने के रूप में 1. अन्य सुविधाओं के अलावा, लघु जीवन चक्र, हैंडलिंग और सिग्नलिंग अणुओं के संरक्षण में आसानी, संरक्षित व्यवहार के तंत्रिका आधार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस का उपयोग करने के लाभों पर प्रकाश डाला.
हर्मेफ्रोडाइट सी. एलिगेंस में आठ डोपाइन्नरजिक न्यूरॉन्स होते हैं; इन के अलावा, पुरुष संभोग प्रयोजनों के लिए छह अतिरिक्त जोड़े शामिल हैं । स्तनधारियों में के रूप में, इन ंयूरॉंस दा synthesize और दा ट्रांसपोर्टर (DAT-1), एक झिल्ली प्रोटीन dopaminergic ंयूरॉंस, जो synaptic फांक में जारी किया दा परिवहन में विशेष रूप से पाया का इजहार dopaminergic ंयूरॉंस । इसके अलावा, संश्लेषण, पैकेजिंग और डीए की रिहाई के प्रत्येक चरण में शामिल प्रोटीन के अधिकांश कीड़े और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं और, जैसे स्तनधारियों में, दा modulates खिला व्यवहार और चलन C. एलिगेंस2में.
C. एलिगेंस ठोस सतहों और पानी में एक विशेषता थ्रेशिंग व्यवहार के साथ तैरती पर क्रॉल । दिलचस्प है, ंयूटेंट की अभिव्यक्ति की कमी DAT-1 (dat-1) आम तौर पर ठोस सतह पर क्रॉल लेकिन तैराकी बनाए रखने में विफल जब पानी में डूबे । यह व्यवहार तैराकी प्रेरित पक्षाघात, या SWIP कहा जाता था । पिछले प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि SWIP, भाग में, synaptic फांक कि अंततः D2 की तरह postsynaptic रिसेप्टर्स (DOP-3) को उत्तेजित करता में मंहगाई की अधिकता के कारण होता है । हालांकि मूलतः dat में पहचान -1 नॉकआउट पशु3, swip भी जंगली प्रकार दवाओं है कि dat की गतिविधि ब्लॉक (जैसे, imipramine4) और/या डीए रिलीज (जैसे, एंफ़ैटेमिन5) के साथ इलाज पशुओं में मनाया जाता है । दूसरी ओर, औषधीय या आनुवंशिक जोड़तोड़ को संश्लेषण और डीए की रिहाई और डॉ़-3 रिसेप्टर समारोह अवरुद्ध6swip रोकने । एक साथ लिया, इन पहले से ही प्रकाशित डेटा एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में swip की स्थापना की है के लिए व्यवहार प्रभाव का अध्ययन करने के भीतर उत्परिवर्तित प्रोटीन की वजह से डोपाइन्नरजिक synapses3,4,7 और के लिए नियोजित किया जा करने के लिए उपंयास विनियामक मार्ग की पहचान के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन दा संकेतन में शामिल7,8,9,10,11,12। इसके अतिरिक्त, जीवित पशुओं में नशीली दवाओं से प्रेरित व्यवहार के एक आसानी से quantifiable readout प्रदान करके, SWIP dopaminergic synapses5में एंफ़ैटामाइन (amph) और azaperone जैसे ड्रग्स की कार्रवाई के तंत्र के स्पष्टीकरण सक्षम बनाता है, 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP assays प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल16से पहले वर्णित किया गया है । यहां, हम विस्तार से पद्धति और स्थापना के लिए सी एलिगेंस समुदाय के लिए एक दृश्य गाइड प्रदान करने के लक्ष्य के साथ परख प्रदर्शन करने के लिए प्रभावी रूप से swip प्रदर्शन का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम सी एलिगेंसमें एक व्यवहार परख, swip, प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल सरल और कोई प्रमुख तकनीकी इस परख बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने बाधाओं के साथ सीधा है । फ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक के लिए डॉ. ओसामा SWIP के स्वचालित विश्लेषण के साथ मार्गदर्शन के लिए Dr. रेंडी है Blakely प्रयोगशाला से Refai शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम NIH R01 DA042156 से नियंत्रण रेखा से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referencias
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