Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

A neurogênese adulta é um processo biológico pelo qual novos neurônios nascem em um adulto e integrados nas redes neurais existentes¹. Nos seres humanos, este processo ocorre no giro dentado (DG) do hipocampo, onde cerca de 1.400 novas células nascem a cada dia². Estas células residem na parte interna da DG, que abriga um nicho neurogênico, denominado zona zona (SGZ). Aqui, células-tronco neurais adultas hipocampais (NSCs) passam por um processo complexo de desenvolvimento para se tornarem neurônios totalmente funcionais que contribuem para a regulação de funções cerebrais específicas, incluindo aprendizagem e memória, regulação do humor e resposta ao estresse^{3 ,4,5,6}. Para influenciar comportamentos, os NSCs adultos são altamente regulados por vários estímulos externos de uma forma dependente da atividade, respondendo a uma variedade de pistas químicas locais e distais. Estas pistas químicas incluem neurotransmissores e Neuromoduladores e atuam em um circuito de maneira específica de várias regiões cerebrais. Importante, a convergência de circuito largo destes sinais químicos em NSCs permite o regulamento original e preciso da ativação, da diferenciação, e das decisões do Fate da pilha de haste.

Uma das maneiras mais eficazes de interrogar a regulação do circuito de NSCs adultos in vivo é através da análise de imunofluorescência de emparelhamento com manipulações de circuito largo. A análise da imunofluorescência de NSCs adultos é uma técnica comumente utilizada, onde os anticorpos contra marcadores moleculares específicos são usados para indicar o estágio de desenvolvimento de NSCs adultos. Estes marcadores incluem: Nestin como uma pilha radial do glia e um marcador neural adiantado do progenitor, Tbr2 como um marcador intermediário do progenitor, e DCX como um marcador do neuroblast e do neurônio imaturo⁷. Adicionalmente, através da administração de análogos da timidina como BrdU, Cidu, IDU e edu, as populações de células submetidas à fase S podem ser rotuladas individualmente e visualizadas^8,9,10. Combinando essas duas abordagens, uma ampla gama de perguntas pode ser investigada, variando de como a proliferação é regulada em estágios específicos de desenvolvimento, a forma como várias pistas afetam a diferenciação de NSC e a neurogênese.

Existem várias opções para manipular eficazmente os circuitos neurais, incluindo a estimulação elétrica, optogenética e quimiogenética, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. A estimulação elétrica envolve uma cirurgia extensiva onde os elétrodos estão implantados a uma região específica do cérebro que sejam usadas mais tarde para transmitir sinais elétricos para modular uma região alvejada do cérebro. No entanto, esta abordagem carece de especificidade celular e de circuito. A optogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor ativado por luz que é estimulado por um laser emitido através de uma fibra óptica implantada, mas requer manipulações extensas, grande custo e cirurgias complexas¹¹. A quimiogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor de designer ativado exclusivamente por drogas de grife ou DREADDs, que são subsequentemente ativados por um ligador específico e biologicamente inerte conhecido como N-óxido de clozapina (CNO)¹² . A vantagem de utilizar DREADDs para manipular circuitos neurais locais que regulam NSCs adultos reside na facilidade e várias rotas de administração CNO. Isto permite uma aproximação menos demorada com manipulação animal reduzida, que é facilmente adaptável para estudos a longo prazo para modular circuitos neural.

A aproximação descrita neste protocolo é uma coleção detalhada de vários protocolos exigidos para interrogar com sucesso a regulação do circuito da neurogênese hippocampal adulta que combina técnicas da imunofluorescência e manipulações do circuito usando a quimiogenética. O método descrito no seguinte protocolo é apropriado para estimular ou inibir um ou vários circuitos simultaneamente in vivo para determinar sua função reguladora na neurogênese adulta. Essa abordagem é melhor usada se a pergunta não precisar de um alto grau de resolução temporal. As perguntas que exigem o controle temporal preciso da estimulação/inibição em uma determinada freqüência, podem melhor ser endereçadas usando o optogenetics^13,14. A aproximação descrita aqui é adaptada facilmente para estudos a longo prazo com manipulação animal mínima especial onde o stress é uma preocupação principal.