JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Externe Laboratoriumbeheer: Respiratoir Virus diagnostiek

Published: April 06, 2019
doi:
10.3791/59188
, , , , ,
1Baylor Global Health,Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine,Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Een snel-inzetbare, off-grid laboratorium is ontworpen en gebouwd voor externe, beperkt resource-globale instellingen. De functies en de kritieke aspecten van de modules van de logistiek-enhanced, uitbreidbaar, multifunctionele laboratorium worden onderzocht. Een checklist voor een basic Labor werkstroom en een protocol voor een respiratoire virale diagnostische test zijn ontwikkeld en gepresenteerd.

Abstract

Een uptick in recente pandemieën (Ebola Zika, MERS, influenza, etc.) onderstreept de behoefte aan een meer ‘lenig,’ gecoördineerde reactie waarin een veelheid van onderwerpen variërend van transport, access, faciliteiten, apparatuur en communicatie naar provider opleiding. Om aan deze behoefte, hebben wij een innovatieve, schaalbare, logistiek-enhanced, mobiel, laboratorium-faciliteit voor noodsituaties en epidemieën in globale instellingen resource-beperkt ontwikkeld. Gebruik makend van een achtergrond in klinische operaties als een academisch medisch centrum, we ontwierpen een snel-inzetbare, modulaire BSL-2 en3 BSL faciliteit met gebruiksvriendelijke software voor het volgen en beheren van geneesmiddelen en leveringen in afgelegen gebieden tijdens epidemieën en uitbraken. Hier presenteren wij onze intermodale, mobiel, uitbreidbaar transportrecipiënt laboratorium-eenheden. Het ontwerp van het laboratorium vergemakkelijkt off-grid gebruik door energieverbruik minimaliseren en het toestaan van alternatieve waterbronnen. Van de eenheid informatie, communicatie technologie (ICT)-platform biedt (i) gebruiksvriendelijke Tablet PC gebaseerde documentatie, (ii) verbeterde tracking van patiënten en leveringen, en (iii) geïntegreerd mededeling ter plaatse met ingebouwde telehealth mogelijkheden. Om kwaliteit in externe omgevingen, hebben we een checklist voor een basic Labor werkstroom en een protocol voor respiratoire virale diagnose met behulp van reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) ontwikkeld. Zoals beschreven, kunt deze innovatieve en alomvattende aanpak voor de levering van laboratorium vermogen in resource-beperkte mondiale omgevingen.

Introduction

Snelle diagnostiek is een essentieel instrument in tijdige virale infectiecontrole, vooral als vroeg symptomatology niet te onderscheiden aan een verscheidenheid van infectieziekten is. De recente uitbraak van de Ebola (2014-2015) in West-Afrika1,2, Zika virus epidemieën (2015-2016) in Azië en Latijns-Amerika3,4, de opkomst van de Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-coronavirus infecties5,6, en de ongewoon dodelijke griep (influenza)-epidemieën (2017-2018) in de Amerikaanse7,8 ontdekt de behoefte van de snel-inzetbare, laboratoriumfaciliteiten die betrekking hebben op een veelheid van kwesties van transport, access, faciliteiten, apparatuur en communicatie.

Off-grid vermogen (autonome macht en watervoorziening, enz.) is van cruciaal belang in de landelijke, beperkt resource-globale instellingen9,10,11. Onze ervaring met klinische operaties en wereldwijde programma’s op Baylor College of Medicine werd gebruikt voor het ontwerpen en bouwen van een container-gebaseerde mobiel laboratorium met mogelijkheden voor eenvoudige implementatie, set-up en multifunctioneel gebruik (BSL-2 en BSL-3). Beelden van deze veelzijdige, logistiek-uitgebreide laboratorium-faciliteit is afgebeeld in Figuur 1.

Dit snel-inzetbare, laboratorium faciliteit heeft een uitbreidbaar ontwerp vergelijkbaar met de eerder beschreven container kliniek (de ‘ Emergency Smart Pod’)12,13,14, ontwikkeld door Baylor College of Medicine en gesponsord door USAID. Een ingepakte eenheid (in de transportmodus) heeft de afmetingen van 9 voet 9 duim x 8 voet x 8 voet (figuur 1A, B), en breidt zich uit tot een oppervlakte van 170 vierkante voet (15.75 m2) (Figuur 1 c, D). De eenheid kan worden geïmplementeerd door twee tot vier personen in minder dan tien minuten.

Het extern laboratorium is gebouwd voor een BSL-2 lab faciliteit (figuur 2A) met een aparte, modulaire, monteerbare, BSL-3-eenheid (figuur 2B) ontworpen voor werk met infectieuze agentia die leiden ernstige of potentieel dodelijke ziekte bij inademing tot kunnen 15. de connectiviteit van de twee laboratorium modules kunt optimalisatie van experimenten werkstromen, verdeling van de middelen, en kosten te besparen (Figuur 2 C-E).

De modules zijn luchtdicht en waterdicht maken van een comfortabele, energie efficiënte mobiele schuilplaats. Verwarming, ventilatie en airconditioning (HVAC) systeem wordt gebruikt voor gecentraliseerde en temperatuurgevoelig eenheden. In het algemeen, minimaliseert het ontwerp van de laboratorium-eenheden stroomverbruik kan worden verlaagd door gebruik van hun eigen alternatieve energiebronnen zoals zonnepanelen en/of een onafhankelijke elektrische generator. Elke eenheid bevat een wastafel en boerenbedrog station, elektriciteit en water aansluitingen (Figuur 3A-C). Het ICT-platform levert een optionele, Tablet PC gebaseerde (Android telefoon/Tablet of iPhone/iPad) documentatie app voor levering volgen en laboratorium resultaat documentatie (figuur 3D) ontwikkeld in partnerschap met Baylor’s informatie technologie (IT) Onderzoeksgroep die is goed ervaren in het werken in externe omgevingen met beperkte verbindingen. Het systeem kan functioneren met behulp van cellulaire of draadloze signalen en kunt documentatie zonder connectiviteit, met onmiddellijke back-up of de overbrenging naar een veilige-cloud gebaseerde server wanneer verbinding hersteld is.

Het laboratorium heeft een aantal belangrijke infectie-controle functies inclusief: (a) negatieve druk air flow, (b) een handschoenenkastje of bioveiligheid, (c) een gezondheid risicobeheer kastensysteem: een kiemdodende ultraviolet (UV-C) verlichtingssysteem met behulp van 4 hiërarchieën van defensie bewezen te elimineren 99,7% van ziekteverwekkers die gezondheidszorg-gerelateerde infecties veroorzaken. De faciliteit wordt gemakkelijk ontsmet met waterstof peroxide of natriumhypochloriet (bleekwater) systemen voor efficiënte en doeltreffende ontsmetting. 16

De zekerheid van kwaliteit laboratoriumresultaten hangt af van een verbintenis tot het beoordelen van alle aspecten van het geheel van diagnostische testproces. Wij presenteren hier een checklist voor de BSL-2 en3 BSL laboratorium-workflow, en een protocol voor snelle respiratoir virus diagnostische test. De voorgestelde diagnose van virale ziekten is afhankelijk van de detectie van virale RNA of DNA in monster (nasale wassen, bloed, ontlasting, en urine, enz.) door middel van real-time omgekeerde-transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR). De mogelijkheid om snel schatten virale ladingen in een monster maakt PCR een doeltreffend instrument voor virale ziekte screening17,18. De implementatie van roman, moleculaire diagnostische tests maakt het mogelijk uitbreiding van de diagnostische mogelijkheden voor virussen zoals Ebola19,20,21, influenza8,22, en tuberculose (TB )23.

Het doel van dit werk is het valideren van een roman modulair en snel-inzetbare laboratorium inrichting en bieden een opleidingsgids voor laboratoriumpersoneel werken in afgelegen, lage-resource omgevingen tijdens een epidemie, natuurrampen of andere noodhulp situatie. Hier presenteren we een protocol voor respiratoire influenza diagnose in deze innovatieve, draagbare laboratorium.

Protocol

1. installatie Opmerking: Alleen 2-4 personen nodig zijn voor de implementatie van de eenheid “Lego-achtige” laboratorium. Optimaal, 4 personen zou worden gebruikt om te implementeren, maar het is mogelijk met slechts 2. Gebruik een vorkheftruck (figuur 1A,B) of andere geschikte hefinstallatie aan het handvat van de container. Gebruik een vorkheftruck met ten minste zeven ton hijscapaciteit om de twee soorten containers24. Voor het instellen van een laboratorium-eenheid, selecteer u een patch van ongeveer 90 x 60 vierkante voet (27,4 x 18.3 m2) op een vlakke landschap om ervoor te zorgen dat geen obstakels belemmeren de juiste lay-out. Zorg ervoor dat de site goed gedraineerde bodem te verzekeren drainage op de operatieplaats omdat dit kan leiden tot problemen met water dissipatie na regen vallen. Gebruik gronden die eerder herverdeeld en die harde verdichte bodem van een minimale drukvastheid van 10 kN/dm-2. De omgeving moet toegang tot de apparatuur die nodig is voor het lossen van de eenheid van zijn apparaat overbrengen en geschikt voor ondersteuning uitrusting die nodig is om de taak te volbrengen. De eenheid of eenheden in haar ‘transportmodus’ plaats in het midden van de geselecteerde site en stel het niveau. Elke eenheid is uitgerust met vier herverdeling aansluitingen om implementatie op een site die een maximale graad van 6,5% (~ 4 graden heeft). De minimale hoogte voor de containers is ~ 6 duim om ervoor te zorgen dat de vloerafvoer en geen kwijting pijpen goed werken. Zich niet uitstrekt aansluitingen meer dan 12 inch. Bevestig de beugel van de steun aan de tak van de aansluiting. Zorg ervoor dat de container niveau door het plaatsen van een zeepbel leveler in het midden van elk spoor van de bodem. De eenheid niet uitbreiden totdat het juiste wijze is geplaatst! Vouw de eenheid door het openen van de panelen voor volledige functionaliteit. Ten eerste vinden de twee-delige steun paal. Sluit de steun paal zodat de hoogte bijna zo hoog als de eenheid van de container is. De paal kan de gebruiker het deelvenster openen en ondersteunen van het gewicht van het dakpaneel zoals de zijdeuren zijn geopend. Er is een veiligheid clip die fungeert als een PIN-code om te houden van de panelen vergrendeld. Verwijder de veiligheid clip eerst, dan heffen en trek de cam lock pin uit het gat. Plaats de pin achter de hendel en uit de weg van de cam lock hendel aan de onderkant (uitbreidbaar) zijden van de container. Hef het dak paneel 1 gezien het feit dat dit panel gas heeft stutten en zodra de paneeldeuren ontgrendeld zijn, de stutten zal vrijgeven. Dit zal zorgen voor de gebruiker te verhogen van het dak (paneel 1) met behulp van de twee-delige ondersteuning polsstok. Verplaats de steun paal de tip onder het dakpaneel tijdelijk ondersteunen (figuur 4A). Terwijl bedrijf van het dakpaneel met de ondersteuning-poke, vinden de veiligheid-keten, gelegen op de top linkerkant van de container. Met de hulp van 2-3 personen, zorgvuldig sleept u omlaag Panel 2 totdat de veiligheidsketting rechte, houden van het gewicht van het deelvenster 2 is en bezig is. Sluit de lier riem riem de lug montage met de hand door het te verpakken rond de buitenkant van het gas strut. Opmerking dat als er geen hulpmiddel van Lier is, de vorige stap handmatig kan worden aangevuld met ten minste twee mensen aan weerskanten van het deelvenster handmatig houden en verlagen.Let op: Het gewicht van het panel is 260 pond! Zorgen zijn er geen mensen of objecten in de weg van Panel 2 en met behulp van de lier en boren, gaat u verder met het verlagen van het deelvenster (figuur 4B). Wanneer het deelvenster 2 volledig wordt verlaagd, de verbinding verbreken de lier riem en spoel het terug in de lier. Verwijder de lier en plaats het aan de andere kant van de container in voorbereiding voor gebruik. Beide zijden van de eenheid zijn identiek en volg dezelfde stappen boven voor de andere kant van de eenheid. Volledige implementatie van de eerste kant, reiken naar beneden naar het deelvenster (die momenteel het woord) en met ten minste twee mensen aan weerskanten, handmatig heffen paneel 3 omhoog op zijn plaats als de deur en de voorwand van de zijde (figuur 4C). De twee mensen blijft beschikbaar voor het vasthouden van deelvenster 3, terwijl de derde persoon de steun paal verwijdert.Let op: niemand moet binnen de eenheid of onder het dak tot de Panel-3 muur is op zijn plaats! Vanaf de binnenkant van deelvenster 3, zoek de twee vergrendelingen en vergrendelen in plaats met behulp van de riem van de veiligheid. Zorg ervoor dat de zwarte dak deelvenster rubberdichting zijn teruggetrokken op gezicht de binnenkant van de eenheden. Dit moet worden gedaan om te voorkomen dat de regen en de penetratie van andere water in de eenheid. Vanaf de binnenkant van de container, Panel 4 te ontgrendelen. Eenmaal geopend, uitduwen Panel 4 (Figuur 4 d) zodat het swingt als een deur open. Veiligheid van de vergrendeling van de twee zakken op binnenwand. Deelvenster 5 ontgrendelen en herhaal de zelfde stappen voor Panel 4. Beveilig dit paneel met dezelfde interne veiligheid sloten. Zodra de gehele eenheid interieur geweest op slot heeft, draai opnieuw de turnbuckle totdat de vloer en einde muren zijn verzegeld. Zodra beide zijden van de container voor het veilig worden uitgevouwen, Controleer de aansluitingen en eventuele noodzakelijke aanpassingen van de verschuiving die zich mogelijk hebben voorgedaan. De shelter wekelijks niveau te controleren. Na de extreme weersomstandigheden (regen of wind) aansluitingen op containers inspecteren en dienovereenkomstig aan te passen. Breid uit de tweede als de aansluitbaar laboratorium modules zijn gepland voor gebruik (Figuur 5). Verbind de toestellen naar energiebron en watervoorziening. Een gedetailleerde instructies over de installatie van een diesel aggregaat aangesloten op de eenheden door een breker vak kan worden gevonden in de bijhorende handleiding24.Opmerking: De externe laboratorium-eenheid wordt nu geïmplementeerd. Het innerlijke niet-opvouwbare volume van de eenheid staat voor het opslaan van minimum van de apparatuur en laboratorium levering nodig voor specifieke diagnostische tests. Installatie van overdruksystemen systeem voor BSL-3 module wordt beschreven in detail24 en vereist extra kwaliteitscontrole. 24 2. checklist voor persoonlijke bescherming en basic Labor workflow Opmerking: Een fout in een van de algemene veiligheid en laboratorium vereiste fasen vervalt mogelijk de resultaten van het gehele testproces. Voordat het voorbereiden aangeven in welke eenheid geïnstalleerd laboratorium, ervoor zorgen dat alle veiligheidseisen voor BSL-2 of BSL-3 worden verantwoord: dressing met juiste personeel beschermingsmiddelen (PBM), wassen van de handen, dragen van handschoenen en decontaminatie van alle werkruimten die zijn om te worden gebruikt. Volg de checklist in tabel 1 waarin veiligheidseisen voor persoonlijke bescherming tijdens tests in het lab BSL-2 en de BSL-3 module (de geassembleerde handschoenenkastje kamer – onderdruk en PCR kamer – overdruk) worden uitgevoerd. Decontaminatie alle werkruimte en leveringen in het laboratorium. Als de planning met natriumhypochloriet-oplossing (0,5%), ook bekend als vloeibare bleekmiddel, decontaminatie van de werkruimte en de leveringen, ook gebruik maken van 70% ethanol te reinigen van alle gebieden die zijn blootgesteld aan het bleekmiddel, als bleekmiddel kan mengen met andere chemicaliën in de werkruimte maken van giftige dampen. Beschikken over alle bleekmiddel producten in hun eigen aangewezen huisvuil. Voordat u begint te werken in het laboratorium-eenheid, vertrouwd raken met de rangschikking en indeling. Strikte regels gelden voor de verwerking van de monsters in de kamer handschoenenkastje (GB). De GB-kamer is negatieve druk! Controleer de instructies van de fabrikant om te werken een handschoenenkastje. Meerdere bronnen geven gedetailleerde zelfstudies over handschoenenkastje operatie25.Opmerking: Het doel van deze test is te extraheren en te zuiveren van RNA zuur (RNA) of deoxyribonucleic acid (DNA), indien aanwezig, van specimens. De uitgepakte RNA/DNA zal getest worden door een RT-PCR in real time de aanwezigheid of afwezigheid van gerichte virale ziekteverwekkers – influenza (INF) op te sporen. 3. snelle influenza virus diagnostiek door RT-PCR in een laboratorium-faciliteit van BSL-2 Ontvangen en registreren De checklist solliciteren PPE (zie sectie 2). INF is een klasse 2-agent BSL-2 praktijk vereisen. PPE geschikt voor BSL-2 praktijk is vereist. Daarnaast Draag veiligheidsbril en radialis mouw Labjassen om te minimaliseren van de potentiële blootstelling van de huid. Volgens de World Health Organization (WHO) aanbevelingen26, gebruiken steriele Dacron of rayon swabs met kunststof schachten voor bemonstering van de luchtwegen.Opmerking: Katoen of calcium alginaat wissers, of swabs met houten stokken kunnen bevatten stoffen die inactivering van sommige virussen en remmen van PCR testen26,27. Zoals monster wissers zijn ontleend aan patiënten, [LbMarket_Transport] hen naar de faciliteit van het laboratorium van het veld of de kliniek. Overdracht monsters via de Pass Through-venster; Dit venster kan niet worden geopend vanaf beide zijden. In het venster Pass Through-spray buizen met monsters met een bleekwater voor 1 min gevolgd door 70% ethanol en veeg droog zodat adequate ontsmetting voordat ze aangeven in welke eenheid laboratorium. Na de onderdompeling, de lab technicus binnen de eenheid zal de Pass Through-venster openen en het verzamelen van de monsters uit de container bleekmiddel te worden geregistreerd. Meestal, zijn de persoon passeren van het monster en de extractie van het monster persoon niet hetzelfde. Open het venster Pass Through- en het verzamelen van de monsters worden geregistreerd. Veeg beneden monsters die waren gedesinfecteerd in bleekmiddel en ethanol. Veeg beneden het interieur van de Pass Through-venster met bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol oplossing. Registreer een steekproef binnen interactieve tablet-computer of een laptop. Het identificeren van een monster met de volgende informatie:-De afhaaldatum-Onset datum-Patiënt leeftijd en geslacht-Specimen type (bijvoorbeeld., neusuitstrijk)-Eenduidige identificatienummers-Overige relevante informatie Barcodes voor het labelen van buizen gebruiken. Streepjescode aan elke monsterbuisje en vier lege buizen aangewezen aliquots toevoegen. Verplaats de monsters naar de vent kap. Scannen van een barcode op elke buis en ervoor te zorgen dat de juiste monster identificatiegegevens op de Tablet PC gebaseerde systeem of laptop scherm verschijnt. Als streepjescodes niet beschikbaar zijn, gebruik een alcohol resistente marker. Altijd markeren het flesje zelf, nooit het GLB, als dit tijdens de behandeling kan krijgen ontstoken! De registratie te voltooien. Monster monster Zodra de reageerbuisjes moeten zijn geëtiketteerd, gebruiken een gecertificeerde klasse 2 bioveiligheid kabinet aliquots van monsters te behandelen van monsters. Een aliquot deel kan worden gebruikt voor het testen van de onmiddellijke en de anderen bewaard voor referentie doel of nacontrole. Als monsters met neusuitstrijk tip in de virale transportmedium aankomen, wakkeren de tip voor het doekje in het medium voor 30 s en squeeze het tegen de zijkant van de flacon. Verwijder het uit het medium en de afzet van het met een biohazardous afval protocol (op de juiste wijze verwijderen, autoclaaf of hangen in 1:100 chlooroplossing).Opmerking: De kleinste hoeveelheid medium dat moet worden opgeslagen is 0,5 mL. Dus, kan een 3 mL monster worden onderverdeeld in zes aliquots (sub monsters). Gebruik 1 mL cryo-opslag tube voor elk monster van 0,5 mL te bieden extra volume voor bevroren medium. Bij het nemen van aliquots, verse steriel of wegwerp pipetten gebruiken voor elk monster en gooi ze in biohazardous afval containers om te voorkomen van kruisbesmetting. Zorg ervoor dat elke buis strak verzegeld en gesloten. Gebruik maken van één aliquot per specimen voor onmiddellijke extractie en eventuele andere aliquots bewaren in de vriezer (bij-80 ° C als het is een respiratoire specimen) voor toekomstig gebruik. Schoon alle oppervlakken van de werkruimte en apparatuur met bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol oplossing voordat hij naar de werkplek. Extractie en zuivering Te verzekeren van kwaliteit van testen, zet de barcoded proeven PCR aliquots uit monster behandeling gebied naar de werkplek (BSL-2 veiligheidskast) aangewezen voor extractie. Deze veiligheidskast heeft een aparte set met pipetten voor behandeling van het monster. Gebruik de virale RNA mini kit voor extractie van RNA monsters. Volg de instructies van de fabrikant voor zuivering van viraal RNA door spin protocol. Bereiden master mix volgens het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Houd de steekproef en cellysis buffer master mix bij kamertemperatuur. Bereid het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Label de 1,5 mL micro-centrifuge buizen met de barcode nummers of unique identifier. Stel de pipet 560 µL. toepassen in een schone pipette uiteinde. 560 µL van de lysis-buffermengsel toevoegen aan elke gelabelde buis. Gooi de tip. Een schone pipette uiteinde van toepassing. Voeg 140 µL van het monster. Verwijderen oude en een schone pipette uiteinde van toepassing. Herhaal met het andere monster. Een schone pipette uiteinde van toepassing. 140 µL buffer aan negatieve controle buis toevoegen. Elke buis veilig sluit. Puls-vortex sample aliquoot 1 met de lysis-buffermengsel voor 15 s. herhalen met monster aliquoot 2 en de controle-buis. Micro-centrifuge elke proef voor 5 s. Incubate de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na 10 min van incubatie, centrifugeren opnieuw de buizen Schakel eventuele druppels van binnenkant van de deksel van elke buis. Voeg 560 µL van ethanol oplossing aan monster. Het uiteinde van de Pipet wijzigen Herhaal met elke resterende of aanvullende monsters. Elke monsterbuisje veilig sluiten en pulse-vortex elke proef voor 15 s. Micro-centrifuge de monsters voor 5 s. Breng het mengsel aan de spin-kolom. Verkrijgen van schone 2 mL collectie buizen. Spin kolommen toevoegen en labelen hen zodat deze overeenkomen met de monsters. Breng 630 µL van monster naar overeenkomende kolom, dienovereenkomstig. Veilige caps en verplaats naar de centrifuge. Verdeel de monsters in de centrifuge. Centrifugeer bij 6.000 × g voor 1 min te verwijderen van de lysis-buffermengsel. Terug naar de werkplek. Collectie buizen vervangen. Voeg de resterende lysis-buffermengsel en herhaal de stap van centrifugeren. Het negeren van de oorspronkelijke aliquoot buizen. Vervreemden van het eluaat en het wassen van de spin-kolom met twee buffers. Toepassing 500 µL van Buffer AW1. Herhaal met elke steekproef. Veilige caps van elk monster en centrifuge op 6.000 × g voor 1 minuut. Herhalen met de tweede Buffer AW2 samen en centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 3 minuten. Ten slotte elueer de RNA door elutie buffer toe te voegen. Plaats van de kolom in een schone 1,5 mL-buis, opent u de kolom en voeg 60 µL van Buffer AVE. Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 min en centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 minuut. De monsters zijn nu klaar voor PCR analyse. PCR versterking en opsporing De PCR-amplificatie in een aparte ruimte aangewezen voor PCR uitvoeren. Verrichten de PCR versterking van het virale doel met behulp van PCR protocol voor één stap procedure volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking, een master mix wordt gemaakt met behulp van virale specifieke primers, sondes, 2 x rechts-PCR buffer en RT-PCR enzym. De master mix toevoegen aan platen of buizen en voeg vervolgens en meng afzonderlijke monsters (zie punt 4.4). Overdracht van de plaat met de PCR-machine en uitgevoerd volgens de voorwaarden van virale doel versterking. Wanneer monsters zijn geladen op het PCR-instrument duurt ongeveer 90 minuten in beslag van de run. Onderhoud na het gebruik van apparatuur Het uitvoeren van regelmatige en periodieke onderhoud na het gebruik van de apparatuur volgens de tabel 2. 4. snelle influenza virus diagnostiek door RT-PCR in een laboratorium-faciliteit van BSL-3 Opmerking: Onder BSL-3-omstandigheden, de experimentele protocol blijft hetzelfde, maar veiligheidsmaatregelen prevaleren boven alles. Alvorens de BSL-3-laboratorium, kijk door het transparante venster om zeker te zijn dat er onderdruk is ontstaan in het handschoenenkastje eenheid. Het zal blijken dat er onderdruk is ontstaan als een roze bal in een muur zichtbaar is. Ontvangen en registreren Zodra de onderdruk is vastgesteld, de deur open en aangeven in welke eenheid. Handen onmiddellijk wassen en ga vervolgens verder met de PPE-Fractie. Toepassen van de controlelijst voor de PPE en workflow BSL-3 (zie punt 2). Gaat u verder met het zetten van de PPE in de volgende volgorde: onder handschoenen, jas, schoen covers, masker, gelaatsscherm, tweede paar handschoenen. Het dragen van een volledige jurk die het hele lichaam beschermt wordt aanbevolen. Zet op de machine en laat druk in het handschoenenkastje te stabiliseren. Gebruik een bleekmiddel spray oplossing om alle gebieden en leveringen moet worden gebruikt binnen en buiten het handschoenenkastje gesaneerd. Vervreemding van bleekmiddel afvalproducten enige verpakkingsgasssen bleekmiddel. Gebruik 70% ethanol oplossing uit alle gebieden voor bleekwater schoon te maken is gebruikt. Het monster overzetten via de Pass Through-venster.Opmerking: Voordat wegvalt op pass through-venster, desinfecteren buizen monsters bevattende ondergedompeld in een bad van hypochloriet voor 1-2 min. met name, spray monsters met een bleekwater-oplossing en laat alleen voor ten minste 1 min. en Pass Through-alvorens ze te ontvangen binnen de BSL-3-eenheid. De persoon die het passeren van het monster van buiten en degene die ontvangt, mag extractie van het monster in BSL-3 laboratorium niet hetzelfde. Ontvangen van de monsters in de BSL-3-eenheid en schoon ze vóór de procedure voor de registratie en labelling van stappen. Registreer een monster met het interactieve tablet-computer of een laptop. Identificeren van een monster met de volgende informatie (zie punt 3.1.5). Barcodes voor het labelen van buizen gebruiken. Als streepjescodes niet beschikbaar zijn, gebruik een alcohol resistente marker.Opmerking: Mark altijd het flesje zelf, nooit het GLB als dit tijdens de behandeling kan krijgen ontstoken! Monster monster Zodra monsters zijn geregistreerd en buizen heeft het label, plaatst u de monsters in de gecertificeerde handschoenenkastje via de lucht vergrendelde lade voor het ophalen van de monsters van in het handschoenenkastje. Sluit de deur. Open vervolgens de andere deur door middel van het handschoenenkastje voor het ophalen van de monsters. Beide deuren niet tegelijk openen. Openen en sluiten van elke deur in twee verschillende stappen voor veiligheidsmaatregelen. UV-C verlichting inschakelen. Zodra de monsters is veilig opschuift naar het handschoenenkastje binnenland, volg de stappen beschreven voor het maken van monster aliquots in een handschoenenkastje. Een aliquoot gedeelte van het monster kan worden gebruikt voor het testen van de onmiddellijke en de anderen bewaard voor referentie doel of nacontrole. Exemplaren komen met neusuitstrijk tip in de virale transportmedium. Nemen van monsters en zet een in elke flacon. Roer de swab-tip in het medium voor 30 s en squeeze het tegen de zijkant van de flacon voordat het verwijderen van het medium en verwijdering het gebruik te maken van een biohazardous afval protocol (op de juiste wijze verwijderen, autoclaaf of hangen in 1:100 chlooroplossing).Opmerking: De kleinste hoeveelheid medium dat moet worden opgeslagen is 0,5 mL, gebruik 1 mL flesjes voor dit doel. Dus, kan een 3 mL monster worden onderverdeeld in zes aliquots (sub monsters). Verse steriel of wegwerp pipetten gebruiken voor elk monster en zich te ontdoen van hen als biohazardous afval. Zodra de steekproeven aliquoted zijn, verplaatsen de monsters in de luchtdichte verpakking. Sluit flesjes met bescherming en verwijderen uit het handschoenenkastje. Binnen het handschoenenkastje, sluit de biohazard afval zak en voorbereiden van een nieuwe afval zak om kruisbesmetting te voorkomen. Ontsmetten van de werkruimte van de handschoenenkastje bleekmiddel voor 5 min en 70% ethanol oplossing daarna toe te passen. Gebruik maken van één aliquot per model voor onmiddellijke analyse en bewaar anderen in de diepvries bij-80 ° C omdat er een respiratoire specimen. Na decontaminatie behouden een aliquoot gedeelte voor het testen, verplaatst u alle monsters uit handschoenenkastje voor opslag in de vriezer-80 ° C. Extractie en zuivering Na desinfectering, gaan de barcoded monster aliquots nodig voor PCR analyse van het specimen behandeling gebied terug in het handschoenenkastje. Voer alle stappen van de lysis van de voor de extractie procedure in het handschoenenkastje. Gebruik de virale RNA mini kit voor extractie van RNA monsters volgens de instructies van de fabrikant. Volg de stapsgewijze instructies voor zuivering van viraal RNA door spin protocol in de instructies van de fabrikant. Bereid het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Label de 1,5 mL micro centrifuge buizen met de barcode nummers of unique identifier. 560 µL van de lysis-buffermengsel aan 140 µL van het monster en pulsstand vortex toevoegen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Opmerking: De inactivatie-procedure kan variëren afhankelijk van het soort BSL-3 pathogen dat is uitgepakt en in sommige gevallen wellicht verdere inactivatie nodig. Na de lysis stap, strak verzegelen de caps op elk monster en leg in de perslucht opgesloten overgang (als de centrifuge wordt geplaatst buiten het handschoenenvak). Breng de lysed monsters in bioveiligheid kabinet voor de rest van de procedure.Opmerking: De procedure voor de extractie en opzuivering van RNA kan worden uitgevoerd in het handschoenenkastje of in een doos van de handschoen gevolgd door bio-veiligheid kabinet afhankelijk van de BSL-3 pathogenen en protocollen vereist. Zorg ervoor dat u de werkruimte en de leveringen in het handschoenenkastje opnieuw het gebruik van bleekwater gesaneerd en 70% ethanol oplossing voor het reinigen van alle gebieden blootgesteld eerder aan het bleekmiddel. Volg de stappen in sectie 3.3.6 – 3.3.10 voor de wasmachine en de zuivering van het RNA. Na extractie, schrijven de monsters naar het Pass Through-venster voor PCR analyse. Nadat de monsters is verwijderd en overgedragen, decontaminatie de laboratorium-werkruimte buiten het handschoenenkastje, volgens sectie 2. Voordat het verwijderen van PPE wachten totdat luchtcirculatie in de eenheid veilig het juiste aantal filteren cycli voordat u begint te verwijderen van de Europese Volkspartij heeft bereikt. Onmiddellijk na het verwijderen en verwijdering van alle persoonlijke beschermingsmiddelen in de PPE afvalcontainer, gaat u verder met het wassen van de handen in het laboratorium met water en zeep vóór het verlaten van de eenheid, volgens sectie 2. PCR versterking en opsporingOpmerking: De PCR versterking is uitgevoerd in een aparte ruimte aangewezen voor PCR en verbonden met het handschoenenkastje gebied via pass through-venster. De werkruimte en de leveringen moeten worden ontsmet voordat een test. De uitgepakte RNA monsters uit de Pass Through-venster verwijderen. De PCR versterking van het virale doel via one-step PCR protocol uit te voeren. Voorbereiding van een master mix met behulp van virale specifieke primers, sondes, 2 x rechts-PCR buffer en RT-PCR enzym. Gebruik van een 1,5 mL tube met de volgende component voor elke gerichte assay: water, primers en sondes, 2 x buffer en RT-PCR enzym. Vortex en draai de master mix. Aliquot de master mix in elk van de strip-buizen. De PCR-kit op opslag in de aanbevolen temperatuur terugkomen zodra de master mix is opgesteld. De afzonderlijke monsters toevoegen aan elk van de strip buizen met behulp van een aparte tip tussen elke strip buis. Draai de monster plaat of buizen bij 1500 t/min voor 1 min. De monsters zijn klaar om te worden geladen op de real-time PCR-eenheid. De plaat met monsters overbrengen in het PCR-instrument en de machine volgens de virale doel versterking voorwaarden uitvoeren. Het duurt ongeveer 90 min te voltooien van één punt. Voordat het verzamelen van de resultaten en het verlaten van het laboratorium, verwijdert u PPE en adequaat gesaneerd elk werkstation en de voorbereiding van de volgende diagnostische test, volgens sectie 2. Onderhoud na het gebruik van apparatuur Het uitvoeren van regelmatige en periodieke onderhoud na het gebruik van de apparatuur volgens de tabel 2.Opmerking: De totale diagnostische doorlooptijd is ongeveer 4 uur. Extractie tijd en PCR instellen van de tijd kan variëren afhankelijk van het aantal monsters en de diagnostische test 4-5 uur of meer kan vergen, dienovereenkomstig.

Representative Results

Het doel van deze studie is om aan te tonen dat de voorgestelde BSL-2 en3 BSL mobiel laboratoriumfaciliteiten bieden een adequate omgeving zodat respiratoir virus diagnostische tests met representatieve resultaten identiek aan de tests die worden uitgevoerd in hoge kwaliteit stationaire laboratoria. Het laboratoriumfaciliteiten zijn ontworpen om te voldoen aan de testvereisten gegeven in de aanbevelingen van de gezondheid op het werk en veiligheid (OHS). Zodra de externe laboratorium faciliteit ingezet (Figuur 4) en alle uitrusting is en benodigdheden zijn geïnstalleerd (Figuur 5), laboratoriumtests kunnen worden uitgevoerd. Volgens laboratorium passende operationele standaardprocedures, PPE (Labjassen, beschermende schoenen, handschoenen, geavanceerde masker, beschermende brillen, enz.) voor BSL-2 praktijk vereist is. Voor BSL-3 de praktijk, is de module laboratorium PCR van onderdruk voorzien van een gecertificeerde handschoenenkastje. De laboratorium-eenheden worden bijgewerkt door externe Pass through-windows om personeel bij de stap van Monster ontvangen. De registratieproces kan worden vereenvoudigd met eerder ontwikkelde Tablet PC gebaseerde applicatie (figuur 3D). Andere aanvaardbare toepassingen die worden uitgevoerd op een laptop kunnen ook worden gebruikt. Deze bijzondere respiratoir virus diagnostische test kan worden uitgevoerd in de modules van de aangesloten laboratorium om te scheiden van de stappen van de diagnostische procedure moedwil verontreiniging of potentieel om storing te voorkomen tussen biochemische reagentia, die invloed kunnen hebben op de testresultaten. Maximaliseren van de kwaliteit van de diagnose, de praktijk van snelle diagnostische test maakt gebruik van (i) zowel de basic Labor BSL-2 en de traverse aangesloten PCR room (sectie 3) of (ii) de GB en PCR kamers verbonden door Pass Through-venster (afdeling 4). Het diagram van de voorgestelde laboratorium workflow is gepresenteerd op Figuur 6 en legt de nadruk op persoonlijke bescherming. Het diagram erkent het belang van elke aangegeven stap voor de bescherming van het personeel, met name als laboratoriumpersoneel in afgelegen gebieden is minimaal getraind. De snelle diagnostische test van influenza wordt bereikt via de RT-PCR-techniek. De procedure bevat vier hoofdstappen. Merk op dat individuele werkruimten worden toegewezen voor elk stadium van het protocol. De eerste stap is het verkrijgen van een monster en het sub in verschillende aliquots verdelen. De aliquots kunnen vervolgens worden gemarkeerd met streepjescodes ter verbetering van de doeltreffendheid van de controle van gegevens en opgeslagen in de vriezer voor verder onderzoek. De tweede stap is om de inactivering van een steekproef in lysis-buffermengsel door centrifugeren en verwarming. De eerste en tweede stappen moeten worden uitgevoerd in de kabinetten van de bioveiligheid. Gebruik afzonderlijke Pipetteer sets en apparatuur. Een PCR-test wordt voorgesteld te worden uitgevoerd in de PCR-kamer, indien beschikbaar. De derde stap is de documentatie van resultaten. Stap 4 is het onderhoud na het gebruik van de apparatuur, en de herinnering aan de bescherming van het personeel aan het einde van het experiment. Als het model wordt verwacht te worden geclassificeerd als BSL-3 + (e.g.,Ebola, Zika, MERS, TB) de faciliteit handschoenenkastje moet worden gebruikt. In de externe laboratorium heeft de GB-kamer eigen Pass Through-raam te ontvangen exemplaren en een laptop of tablet voor Monsterontvangst en registratie. Het monster aliquoot en de inactivering van het virus moeten alle worden uitgevoerd in de zaal van het handschoenenkastje. UV-C verlichting wordt aanbevolen om te voorkomen dat besmetting tijdens de procedure. Na inactivering van een steekproef, verdere stappen voor protocol zijn vergelijkbaar met de basic Labor BSL-2 en BSL-3 test en volgt Checklist deel III (tabel 1, Figuur 6). Figuur 1. Laboratorium faciliteit prototype. (A, B) Transportmodus; (C) geïmplementeerde modus: buiten; (D) geïmplementeerde modus: interieur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 . Schema’s. (A) de basic Labor BSL-2; (B) de BSL-3 module omvat het handschoenenkastje en PCR laboratoria, die een gemeenschappelijk Pass Through-venster voor de overdracht van het beschermde model hebben; (C) verbonden laboratoriumfaciliteiten (A) en (B) met gedeelde hulpprogramma’s. (D,E) Foto’s van de aangesloten eenheden van tegenovergestelde kanten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 3. (A) interieur van de BSL-3-faciliteit heeft (1) een Pass Through-venster, een wastafel en (2) een boerenbedrog station bij de inlaat; (B) elektrische stroom-aansluitingen, (C) Water verbindingsstukken; (D) Tablet gebaseerde software voor levering volgen en laboratorium resultaat documentatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 . Inzet van de faciliteit laboratorium. Instructie voor panelen op één zijde van de eenheid zoals geïllustreerd ontvouwt (A-D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 5 . Schema van het aansluitbaar laboratorium: (A) BSL-2 module 1; (B) handschoenenkastje en PCR module 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 6 . Stroomschema voor een respiratoir virus diagnostische RT-PCR-test in de externe laboratorium faciliteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Externe laboratorium BSL-2 Externe laboratorium BSL-3 Deel I Deel I i. lab tech om door de deur met ingang van het label en zet op laboratoriumjas, die is opknoping op rek naast de deur. Open schoenen zijn verboden, geavanceerde masker en beschermende brillen worden aangemoedigd. i. lab tech kijken naar handschoenenkastje venster van buiten de eenheid te verzekeren van de negatieve druk wordt geactiveerd. (Roze bal moet zichtbaar zijn in de eenheid te tonen dat de negatieve druk werkt). II. Lab-tech te wassen van de handen in de gootsteen, zetten wegwerphandschoenen en beginnen met de inname van monsters. II. als negatieve druk werkt, lab tech invoeren door de enige deur en zet op laboratoriumjas, die is opknoping op rek naast de deur.  Open schoenen zijn verboden, geavanceerde masker en beschermende brillen zijn wenselijk. III. monsters die werden gedipt in hypochloriet Bad voorafgaand aan wegvalt op Pass Through-venster zitten in doorheen voor lab-tech. III. Lab tech te wassen van de handen in de gootsteen, zetten wegwerphandschoenen, PPE en beginnen met de inname van monsters. IV. ontvangen bij de receptie van het monster. IV. monsters die eerder werden gedipt in hypochloriet Bad voorafgaand aan wegvalt bij pass door raam zitten in doorheen voor lab-tech. Deel II v. ontvangen bij de receptie van het monster. v. afhankelijk van diagnostische procedure, specimens verhuisde naar bioveiligheid kabinet en geïnactiveerd. Deel II VI. Specimens klaargestoomd voor microscopie, centrifuge of ROTs. VI. Specimens in handschoenenkastje geïnactiveerd. VII. passende diagnostische tests uitgevoerd. VII. Specimens uitgevoerd voor isolatie van nucleïnezuur. VIII. Bewaar exemplaren in de koelkast 4° C of passende diepvriezer. VIII. na extractie, specimens verhuisde naar Pass Through-venster. Deel III IX. Lab-tech invoert via entree in PCR kant van eenheid (overdruk). IX. gebruik wastafel voor kleuring & wassen van items. x. Lab tech laboratoriumjas zetten uit rek naast ingang, handen in onschuld wassen in de gootsteen, handschoenen zetten. x. gebruik laptop & counterpace voor het uitvoeren van analyses en documentatie. XI. het ontvangen van monsters van handschoenenkastje kamer in Pass Through-venster. XI. het steriliseren van apparatuur door autoclaaf uit te voeren. XII. Indien nodig monsters klaargestoomd in laminaire flow kabinet. XII. verwijdering van alle biohazardous afval in de afvalcontainer van biohazard. XIII. passende diagnostische tests uitgevoerd. XIII. was de handen in de gootsteen. XIV. Bewaar exemplaren in de koelkast 4° C of passende diepvriezer. XIV. Hang laboratoriumjas back-up op rek. Deel III XV. sluit af door dezelfde deur. XV. gebruik wastafel voor kleuring & wassen van items. XVI. het gebruik van laptop & counterpace voor het uitvoeren van analyses en documentatie. XVII. Breng flesjes in Pass Through-venster naar PCR kamer en uitrusting door het uitvoeren van de autoclaaf steriliseren. XVIII. verwijdering van alle biohazardous afval in de afvalcontainer van biohazard. XIX. was de handen in de gootsteen. XX. verlaten via dezelfde ingang deur. Tabel 1. Controlelijst voor de workflow van de diagnostische PCR. Onderhoud en kalibraties Real-time PCR-systemen Maandelijkse Uitvoeren van achtergrond kalibraties elke maand 18 maanden Het uitvoeren van de achtergrond, ruimtelijke en kleurstof kalibraties elke 18 maanden van hetth Centrifuge 1 jaar Kalibreren voor omwentelingen per minuut en temperatuur door middel van externe of interne kalibratie diensten Handschoenenkastje Dagelijkse Inspecteer visueel of elementen, met name voor schade aan de blootgestelde oppervlakken van de HEPA-filters, handschoenen, o-ringen en slangen. Zorg ervoor dat de buis klemmen zijn strak en op zijn plaats. Lek druk test uitvoeren. Test het alarm van de druk. 6 maanden Het HEPA-filter wijzigen 1 jaar Kalibreren van het systeem Autoclaaf Per Reinig de waterreservoir en de rekken met een mild sopje van niet-schurend 3 maanden Kalibreren van de timer en meters 1 jaar of elke 50 cycli Inspecteren, grondig reinigen, testen en kalibreren Koelkast en Freeezer 6 maanden Controleren van de ventilator motor, verdamper opgerold, stofzuigen condenserende spoelen en condensor filters en vervang zo nodig 1 jaar Kalibreren van de vriezer via interne of externe kalibratie diensten Tabel 2. Onderhoud van real-time PCR-materiaal. Verplichte Aanbevolen Laboratoriumjas, beschermende schoenen, handschoenen Laboratoriumjas, beschermende schoenen, handschoenen, maskers, brillen Koelkast 4 ° C, vriesvak-20 ° C Koelkast 4 ° C, vriesvak-20 ° C, vriesvak-80 ° C Een set van geautomatiseerde pipetten Drie sets van geautomatiseerde pipetten Centrifuge, shaker, thermocycler Robotic systeem RT-PCR machine, ijsbad RT-PCR met temperatuurregeling, ijsvrije cooler Biohazard afval zakken Autoclaaf te ontdoen van biohazard afval Tabel 3. Minimumeisen voor de RT-PCR respiratoir virus diagnostische test BSL-2.

Discussion

De faciliteit van de externe laboratorium hierboven beschreven is logistiek-georiënteerde, uitbreidbaar, snel inzetbare, multifunctionele en op basis van mensgerichte ontwerpen die ter bescherming van laboratorium personeel en werkruimte efficiëntie hebben zijn gericht. Het gedetailleerd protocol voor snelle laboratorium set-up en veilige respiratoire virusisolatie en diagnose werd ontwikkeld en gepresenteerd.

Voor optimale uitrusting functioneren, de volgende voorwaarden moeten worden gehandhaafd in het laboratorium-eenheden: omgevingstemperatuur van 21 ± 2 ° C, toelaatbare temperatuur van 5 tot 40 ° C, luchtvochtigheid van 14 ± 5% RH, 80% RH (niet-condenserend), toegestane maximale relatieve luchtvochtigheid en een hoogte tussen 0 en 2000 m boven de zeespiegel.

Energieverbruik is één van de meest belangrijke parameters voor het beheer van een off-grid laboratorium. Voor core laboratoriumapparatuur, kan de energie-efficiëntie verschillen 15-40%; gemiddeld energieverbruik is echter hier geschat om een passende service kunnen bieden. Het hoogste percentage van de macht (1.500-2.000 W) heeft betrekking op de airconditioner, het systeem van ‘ glovebox ‘, de PCR-machine en de autoclaaf sterilisator. Uitgaande van 8 uren intensief werk uitvoeren van het protocol en de 16 uren van het laboratorium milieu-besturingselement, is het dagelijkse energieverbruik van laboratorium eenheden ongeveer 36 kWh/dag voor BSL-2, ongeveer 43 kWh/dag voor BSL-3 en 73 kWh/dag voor de aangesloten BSL-2/BSL-3 + faciliteiten. Voor één eenheid, is het raadzaam een bron van elektriciteit te voorzien van capaciteit van running/continu vermogen ≥8 kW, schommeling/beginnen power ≥10 kW; voor de aangesloten faciliteit, running/continu vermogen ≥12 kW, en surge/beginnen macht ≥14 kW. Let op, in de BSL-3 laboratorium faciliteit, dat een backup energiebron is sterk aanbevolen om onbedoelde stroomuitval vermijden en vast werk van het handschoenenkastje en onderdruk systeem garanderen tijdens een diagnostische test.

Een benzine aangedreven elektrische generator is een kosteneffectieve oplossing voor noodgevallen energievoorziening. Aannemen dat de efficiency van de brandstof van een benzine generator ongeveer 1.5 gallons per uur bij 100% belasting is. Dan, als het gemiddelde dagelijkse energieverbruik is 8 uur 40% laden en 16 uren van 10% belasting, de eenheid van het laboratorium BSL-2 of BSL-3 gallons brandstof per dag, 7-9 vereist dienovereenkomstig en de aangesloten faciliteit moet ~ 15 gal/dag.

De externe laboratorium-eenheden zijn ontworpen om de mogelijkheden van off-grid zonnepaneel systemen passen. Zonnepanelen vereisen geen extra brandstof en kan worden bediend met hoge productiviteit in de tropische en subtropische gebieden van Afrika, Azië en Latijns-Amerika vanwege de hoge zonne-bestraling. Op dit moment kan één eenheid van een commercieel beschikbare zonnepaneel-systeem een dagelijkse stroomverbruik van maximaal 44 kWh/dag.

Ongeacht de geselecteerde soort alternatieve elektrische energiebron, zijn vuile elektriciteit filters sterk aanbevolen en vooraf geïnstalleerd in de laboratoriumfaciliteiten macht kwaliteit te verbeteren en te beschermen van laboratoriumapparatuur. Houd het PCR-systeem uit de buurt van bronnen van elektromagnetische straling van sterke en niet-afgeschermde omdat sterke elektromagnetische straling met de goede werking van het apparaat interfereren kan. Het is ook belangrijk ken geen gebruik maken van het PCR-systeem in de buurt van sterke trillingen, zoals een centrifuge of pomp bronnen omdat buitensporige trillingen instrument prestaties zal beïnvloeden. De laboratoriumapparatuur kan alleen worden geïnstalleerd in een omgeving die nonconductive verontreinigende stoffen, zoals stofdeeltjes of houtsnippers heeft. Zorg ervoor de kamer weg van alle openingen die deeltjes materiaal op de onderdelen van het instrument kon verdrijven.

De laboratorium-waterverbruik is afhankelijk van aantal diagnostische tests uitgevoerd dagelijks en aantal laboranten werken in de faciliteit. Nuclease gratis water voor de voorbereiding van mixers tijdens diagnostische procedure, met inbegrip van extractie en PCR-toets is vereist en moet worden geleverd bij voorbaat als andere benodigdheden en chemicaliën. Ten minste 50 mL nuclease gratis water is nodig om het Voer een diagnostische test; de vereiste hoeveelheid nuclease gratis water hangt af van de werklast (dat wil zeggen, op het aantal monsters). Gedestilleerd water is nodig om te voeren de autoclaaf sterilisator. Autoclaaf waterverbruik in één cyclus is 160-180 mL; de autoclaaf wordt aanbevolen voor dagelijks gebruik. De meeste van de kunststof (buizen, Pipetteer tips, etc.) zijn beschikbaar, maar sommige zijn herbruikbaar en moeten worden gewassen (grote containers, rekken, etc.). Regelmatige stromend water wordt gebruikt voor het wassen van de handen tussen procedures en het minimale volume wordt geschat op 15-20 L dagelijks. Het water moet worden gepompt voor druk; sediment voorfilter systeem wordt aanbevolen de watertoestellen beschermen tegen het schadelijke effect van sediment en ter verbetering van de kwaliteit van het stromend water.

Voor koude opslag, ten minste één 5.1 kubieke voet koelkast (+ 4 ° C) en een 4.9 kubieke voet (-20 ° C tot-30 ° C) vriezer zijn vereist in elk laboratorium-eenheid om te slaan monsters / RNA.

Laboratorium decontaminatie omvat verschillende niveaus: schoonmaken > antisepsis > ontsmetting > sterilisatie. Eenvoudige reiniging kan worden uitgevoerd met behulp van water en zeep tijdens het schrobben met een gehandschoende hand of borstel. Antisepsis bevat wassen met vloeibare antimicrobiële chemische om te remmen van de groei en vermenigvuldiging van bacteriën. Alcohol oplossingen (70%) kan worden gebruikt als een antiseptische vloeistof. Desinfectie is de toepassing van een vloeibare chemische stof op het elimineren van bijna alle pathogene micro-organismen (met uitzondering van bacteriële sporen) op werk oppervlakken en apparatuur. Chemische blootstellingstijd, temperatuur en concentratie van ontsmettingsmiddel zijn belangrijk. Natriumhypochloriet-oplossing (0,5%), of bleekmiddel, is een effectief ontsmettingsmiddel op grote schaal voor oppervlakte zuivering en water zuivering. Ultraviolet kiemdodende bestraling is een andere methode van desinfectie. Een lamp Kiemdodende UV-C licht produceert en leidt tot de inactivering van bacteriën en virussen. Sterilisatie maakt gebruik van een fysische of chemische procedure alle microbiële leven–met inbegrip van zeer resistente bacteriële sporen te vernietigen. Sterilisatie kan met een autoclaaf sterilisator worden uitgevoerd.

Alle laboratoriumafval moet worden gescheiden op het punt van generatie. Plaats solide, niet-sharp, infectieuze afvalstoffen in lekvrije afval zakken gemarkeerd als biohazard. Als de gegenereerde afval is scherp, moet het worden geplaatst in de punctie-resistente containers. Potentieel besmettelijke vloeibaar afval in goed geëtiketteerde biohazard verpakkingen voor vloeistoffen te verzamelen. Containers en zakken moeten niet worden gevuld meer dan 2/3 het volume. De verwijdering van alle bleekmiddel producten moet in hun eigen aangewezen huisvuil worden gesorteerd. Laboratoriumafval moet voorzichtig worden behandeld om te voorkomen dat het genereren van aërosolen en breuk van zakken/containers. Collectie tassen/opslaglocaties met biohazard afval moet worden verzegeld en externe oppervlakken ontsmet na gebruik met 0,5% natriumhypochloriet-oplossing. Alle laboratoriumafval steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten vóór verbranding. Raadpleeg functionerende handleiding voor het juiste gebruik van een autoclaaf. Indien mogelijk, voeg een chemische of biologische indicator aan de autoclaaf om juiste sterilisatie. Alle gesteriliseerde met autoclaaf vast en vloeibaar afval moet duidelijk worden gemarkeerd als gesteriliseerd met de instelling, de datum, de tijd, en de exploitant. De gelabelde afval moet vervolgens worden geplaatst in een afzonderlijke, beveiligde ruimte vóór verbranding.

Zoals verwacht, workflow van diagnostische test is afhankelijk van de ziekte en het model. Als het wordt aanbevolen voor identificatie van het virus voor het verzamelen van bloedmonsters (bijvoorbeeld Ebola19), kunnen monster aliquots bij-20 ° C in plaats van-80 ° C (nodig voor respiratoire virussen) worden opgeslagen. Het is altijd beter om meer dan één exemplaar bij de bemonstering van een patiënt dan aan onderverdelen specimens later. Indien mogelijk, voor elk type specimen moeten ten minste twee exemplaren worden gehouden in aparte specimen buizen. Monsters moeten worden onderverdeeld als aanvullende monsters niet mogelijk is.

Als alternatieve exemplaren kunnen niet worden opgeslagen bij passende temperaturen (bijvoorbeeld geen diepvriezers zijn beschikbaar), swabs moeten worden opgeslagen in pure (100%) ethanol of 99% spiritus (methanol alleen additieven). In dit geval moet de swab-tip in een flesje met de 1-2 mL ethanol worden gebracht. Merk op dat deze specimens alleen geschikt voor PCR zijn. Ook de opmerking dat een gevestigde assay noodzakelijk voor elke specifieke virus diagnose8,23 is, en onbekende virus monsters moeten worden verzonden naar de toegewezen laboratoria voor verdere onderzoeken19,20, 21.

Verplichte en aanbevolen eisen aan de lijst van laboratoriumapparatuur voor respiratoir virus diagnostische PCR-tests moeten worden erkend. Tabel 3 onderstreept en minimaal voortgezette (aanbevolen) apparatuur en vereisten voor de RT-PCR diagnostische test. Voor BSL-3 de praktijk is extra onderdruk bescherming (bijvoorbeeld handschoenenkastje) van personeel belangrijk en noodzakelijk.

De aangesloten laboratorium modules zijn te verkiezen boven het verhogen van het aantal personeelsleden die betrokken zijn bij laboratoriumonderzoek en versnellen de tijd die nodig is voor een single-test. Vervanging van de tijdrovende, handmatige RNA extractie is mogelijk met geautomatiseerde qPCR (bijvoorbeeld QiaCube). Terwijl dit instrument omslachtig is (breedte 65 cm, lengte 62 cm, hoogte 86 cm), het kan de werkruimte mobiel laboratorium na omlegging van meubilair in BSL-2 of BSL-3 eenheden passen.

Toekomstige werkzaamheden zullen worden toegespitst op de ontwikkeling van augmented reality (AR) en virtual reality (VR) trainingen. De AR/VR-bril zal worden gebruikt om een interactief platform om te leren van de nodige vaardigheden die nodig zijn om een goed opgeleide laboratorium werknemer. Nuttige tips voor het uitvoeren van enkele van de moeilijke, meerstaps procedures in laboratorium diagnostische tests zal worden opgenomen in de software gids. Deze aanpak voor de opleiding van personeel moet de verbetering van de kwaliteit van diagnostische test prestaties en beheer in externe laboratoriumfaciliteiten, met name externe en resource beperkt gebieden.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De inhoud van dit artikel weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van de ons Department of Health and Human Services of van de instellingen gelieerd aan de auteurs. Dit onderzoek werd gesteund door Paul G. Allen Family Foundation “Enhanced Zero-Impact, Emergency Smart Pod”. We waarderen diep alle vruchtbare discussies en samenwerking met de collega’s van Baylor College of Medicine, GSS gezondheid, NASA’s Johnson Space Center. Wij zijn oprecht dankbaar Thermo Fisher Scientifics en haar vertegenwoordigers voor een lening van de RT-PCR-machine, centrifuge en geautomatiseerde pipetten te verrichten van een diagnostische test van respiratoir virus in de externe laboratorium faciliteit. De auteurs zijn Marta Storl-Desmond en Sidney Stephen Sorrell dankbaar voor hun hulp bij de voorbereiding van de manuscript en videografie.

Materials

Autoclave Sterilizer 'BioClave' Benchmark Scientific, Edison, NJ, USA B4000-16 16 liter, Benchtop, Dims: 22×17.5×15.7 in, Fully automatic, Extremely Compact
Barcode Scanner Zebra Technologies ZIH Corp., Lincolnshire, IL, USA Symbol LS2208 Handheld, lightweight
Breaker Box Panelboard Enclosure Square D (Schneider Electric), France  MH62WP  NEMA 3R/5/12, Dims: 20 W x 62 H x 6-1/2 in. D, Electrical distribution board
Centrifuge – Microcentrifuge 17,000 x g Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75002440 Holds 24 x1.5 or 2 ml tubes, Dims: 8.9×9.6×13.8 in
Class II Biological Safety Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-602-400 4 Ft. Class II Type A2 Cage Changing Biological Safety Cabinet, 12" Access Opening, HEPEX Pressure Duct 
Class III Biological Safety Cabinet (Glove box) Germfree Laboratories, Ormond Beach, FL, USA Model #PGB-36, Serial #C-2937 Glove box, Portable, 36", Class III BSC. Dims: 36x20x23.75 in, Includes 2 interior outlets
Cryo Coolers VWR, Radnor, PA, USA 414004-286 0.5 or 1.5 ml tube benchtop coolers
Freezer (30°C freezer) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA Model ULT430A To occupy 4.9 Cubic feet
Laminar Flow Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-126-300 3 Ft. Vertical Laminar Airflow Cabinet, 8" Access Opening, HEPA filter supply, 99.99%
Mini Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75004061 Dims: 4.1×5.0x6.0 in
Pipettes automated VWR, Radnor, PA, USA 05-403-151 Pipet 4-pack (2.5,10, 100 and 1,000μL volume)
Pipettes automated 'Finnpipette' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4700880 Pipet 4-pack (2, 20, 200 and 1,000μL volume), Advanced Volume Gearing(AVG), Ultra durable
Power Generator Cummins Power Generation, Minneapolis, MN, USA C60 D6 60 kW, 60 Hz, 1 Phase, 120/240V, Diesel
Refrigerator BioMedical Solutions, Inc., Stafford, TX, USA BSI-HC-UCFS-0504W Standard Undercounter Refrigerators & Freezers
Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 05LRAETSA  To occupy  5.1 Cubic feet
RT-PCR machine 'Step-one plus' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4376598 Holds 96 samples, Dims: 9.7×16.8×20.2 in 
Vortex Mix Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 88880017TS Dims: 6.1×8.3×3.3 in
Chemicals
AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 4387391
Ethanol Koptec Pure 200 Proof Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA V1001
Nuclease-free Water Ambion, Inc., Carlsbad, CA, USA AM9906
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 52906
SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 11732-088
Disposable
1 mL cryogenic tubes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 03-337-7X 
1.5 mL tubes VWR, Radnor, PA, USA 10025-726
10 µL Filter Tips Neptune, VWR, Radnor, PA, USA Neptune, BT10XLS3
20 µL Filter Tips Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, USA MultiMax, P-3243-30X
200 µL Filter Tips ART, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA ART, 2770
1000 µL Filter Tips Phenix Research Products, Candler, NC, USA TS-059BR
AB custom probes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA N/A Custom probes
Combitips Eppendorf, Hauppauge, NY, USA 89232-972
Integrated DNA Technology (IDT) custom probes and primer IDT N/A Custom probes
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 490003-978 CS
MicroAmp Fast Reaction Tubes (8 tubes/strip) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strip Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4323032
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4311971
Supplies
Biohazard waste bags VWR, Radnor, PA, USA 14220-046 20.3 x 30.5 cm Biohazard bags
Gloves Denville Scientific, Holliston, MA, USA G4162-250 Small, meduim or large Nitrile or latex gloves
Lab coat N/A N/A Customizable
Masks VWR, Radnor, PA, USA 414004-663 Advanced protection mask
Protective shoes N/A N/A Customizable
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. World Health Organization (WHO) Ebola Response Team. Ebola virus disease in West Africa – the first 9 months of the epidemic and forward projections. New England Journal of Medicine. 371 (2), 1481-1495 (2014).
  2. World Health Organization (WHO). . Media Center: Ebola Virus Disease Fact Sheet No. 103. , (2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas – yet another arbovirus threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  4. Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika virus outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
  5. Aly, M., Elrobh, M., Alzayer, M., Aljuhani, S., Balkhy, H. Occurrence of the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) across the Gulf Corporation Council countries: Four years update. PLoS ONE. 12 (10), e0183850 (2017).
  6. World Health Organization (WHO). Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) – Oman. Media Center: Disease outbreak news. Mar 18. , (2018).
  7. Ducharme, J., Johnson, D. This flu map shows how the biggest influenza outbreak in years spread across the U.S. Time, Time Health: Public Health. , (2018).
  8. Gaglani, M., et al. Influenza vaccine effectiveness against 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus differed by vaccine type during 2013-2014 in the United States. Journal of Infectious Diseases. 213 (10), 1546-1556 (2016).
  9. Gates, B. The next epidemic – lessons from Ebola. New England Journal of Medicine. 372 (15), 1381-1384 (2015).
  10. Mills, A. Health care systems in low- and middle-income countries. New England Journal of Medicine. 370 (15), 552-557 (2014).
  11. Wölfel, R., et al. Mobile diagnostics in outbreak response, not only for Ebola: a blueprint for a modular and robust field laboratory. Euro Surveillance. 20 (44), 30055 (2015).
  12. Connelly, S. Through innovation, education and collaboration, Baylor Global Initiatives seeks to transform health and patient care worldwide. TMC Pulse, Global Perspective. , (2015).
  13. Hersh, D. USAID funds Ebola ‘smart pod’ project. Federal Times. , (2015).
  14. Waite, A. Emergency Smart Pods – Transforming Containers into Modern Medical Clinics. DipNote, U.S. Department of State Official Blog. , (2018).
  15. . . Guide to US Department of Health and Human Services Regulations. , (2015).
  16. Center for Disease Control and Prevention (CDC). . Website: Clean up after a Disaster. , (2017).
  17. Flannery, B., et al. Enhanced genetic characterization of influenza A(H3N2) viruses and vaccine effectiveness by genetic group, 2014-2015. Journal of Infectious Diseases. 214 (7), 1010-1019 (2016).
  18. Spencer, S., et al. Factors associated with real-time RT-PCR cycle threshold values among medically attended influenza episodes. Journal of Medical Virology. 88 (4), 719-723 (2016).
  19. Cherpillod, P., et al. Ebola virus disease diagnosis by real-time RT-PCR: A comparative study of 11 different procedures. Journal of Clinical Virology. 77, 9-14 (2016).
  20. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay for the detection of Ebola virus (Zaire) during an Ebola outbreak in Guinea in 2014-2015. Journal of Virological Methods. 228, 26-30 (2016).
  21. Cnops, L., et al. Developement, integration of a quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction diagnostic test for Ebola virus on a molecular diagnostics platform. Journal of Infectious Diseases. 214 (3), S192 (2016).
  22. Keitel, W. A., et al. Rapid research response to the 2009 A(H1N1)pdm09 influenza pandemic (Revised). BMC Research Notes. 6, 177 (2013).
  23. Parsons, L. M., et al. Laboratory diagnosis of tuberculosis in resource-poor countries: challenges and opportunities. Clinical Microbiology Reviews. 24 (6), 314-350 (2011).
  24. . . Expandable Bicon Shelter. Commercial Manual. Sea Box. , (2019).
  25. . Lab Safety. Operating the Glovebox. JoVE Science Education Database. , (2018).
  26. World Health Organization (WHO). . Collecting, preserving and shipping specimens for the diagnosis of avian influenza A(H5N1) virus infection. , (2006).
  27. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).

Tags

Remote Laboratory ManagementRespiratory Virus DiagnosticsIntra-modal Laboratory UnitBSL-2 And BSL-3 ApproachRapid Influenza Virus DiagnosticsRCT-PCRPersonal Protective EquipmentPass-through WindowSample SwabsSample AliquotBiosafety CabinetBarcode ScanningSample RegistrationResource-constrained AreasEpidemicsZikaEbolaInfluenza VirusBSL-2 Safety Requirements

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Petrova, E. V., Avadhanula, V., Michel, S., Gincoo, K. E., Piedra, P. A., Anandasabapathy, S. Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics. J. Vis. Exp. (146), e59188, doi:10.3791/59188 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image