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Medicina

Gerencia de laboratorio remoto: Diagnóstico de Virus Respiratorio de la

Published: April 06, 2019
doi:
10.3791/59188
, , , , ,
1Baylor Global Health,Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine,Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Un despliegue rápido, fuera de la red de laboratorio ha sido diseñado y construido para configuración remota, con recursos limitados. Se exploran las características y aspectos críticos de los módulos de laboratorio de logística mejorada, expandible, multifuncional. Lista de verificación para un flujo de trabajo de laboratorio básico y un protocolo para una prueba de diagnóstico viral respiratoria se desarrolló y presentó.

Abstract

Un aumento reciente destaca las pandemias (Ébola, Zika, MERS, gripe, etc.) la necesidad de un más ‘ágil,’ coordinada respuesta que aborda una multitud de cuestiones que van desde transporte, acceso, instalaciones, equipos y comunicación al proveedor formación. Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un centro de laboratorio innovadoras, escalables, logística mejorada, móvil, para emergencias y epidemias en configuración global con recursos limitados. Utilizando un fondo en operaciones clínicas como un centro médico académico, hemos diseñado un despliegue rápido, modular BSL-2 y BSL-3 instalaciones con fácil de usar software para seguimiento y administración de medicamentos y suministros en regiones remotas durante las epidemias y brotes. Aquí, presentamos nuestras unidades de laboratorio contenedor intermodal, móvil y extensible. El diseño del laboratorio facilita el uso fuera de la red minimizando el consumo de energía y permitiendo que las fuentes de agua alternas. Información de la unidad plataforma de la comunicación (TIC) proporciona documentación basados en tablet i fácil de usar, (ii) mejora el seguimiento de los pacientes y suministros y (iii) integrado en el sitio comunicación con telesalud incorporado capacidades. Para asegurar la calidad en entornos remotos, hemos desarrollado una lista de verificación para un flujo de trabajo de laboratorio básico y un protocolo para el diagnóstico viral respiratoria mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Como se describe, permite que este enfoque innovador e integral para la provisión de capacidad de laboratorio en entornos globales de recursos limitados.

Introduction

Diagnóstico rápido es un instrumento fundamental en el control de la infección viral oportuna, especialmente si la sintomatología temprana es comparable con una variedad de enfermedades de infección. El reciente brote de Ébola (2014-2015) en África occidental1,2, epidemias de virus Zika (2015-2016) en Asia y América Latina3,4, la aparición del coronavirus del síndrome respiratorio Oriente (MERS) infecciones5,6y las epidemias inusualmente mortal gripe (influenza) (2017-2018) en los Estados Unidos7,8 descubrieron la necesidad de instalaciones de laboratorio rápidamente desplegables, que se ocupan de una multitud de temas de transporte, acceso, instalaciones, equipos y comunicación.

Capacidad fuera de la red (potencia autónoma y suministro de agua, etc.) es crucial en la configuración global rural, con recursos limitados9,10,11. Nuestra experiencia en operaciones clínicas y programas globales en el Baylor College of Medicine fue utilizado para diseñar y construir un laboratorio móvil basada en contenedores con capacidades de fácil implementación, configuración y uso de múltiples funciones (BSL-2 y BSL-3). Imágenes de esta instalación versátil, logísticamente mejorado de laboratorio se muestra en la figura 1.

Este rápidamente desplegables, laboratorio tiene un diseño extensible similar a la clínica de envase previamente descritos (la ‘ emergencia inteligente Pod’)12,13,14, desarrollado por el Colegio Baylor de medicina y patrocinado por USAID. Una sola unidad embalada (en modo de transporte) tiene las dimensiones de 9 pies 9 pulgadas x 8 pies x 8 pies (figura 1A, B) y se expande a un área de 170 pies cuadrados (15,75 m2) (figura 1, D). La unidad puede implementarse de dos a cuatro personas en menos de diez minutos.

El laboratorio fue creado para una instalación de laboratorio BSL-2 (figura 2A) con un separado, modular, acoplables, BSL-3 unidad (figura 2B) diseñada para trabajo con agentes infecciosos que pueden causar enfermedad grave o potencialmente letal por inhalación 15. la conectividad de los módulos de dos laboratorio permite la optimización de flujos de trabajo de experimentación, intercambio de recursos y ahorro (Figura 2C-E).

Los módulos son herméticas y estancas para crear un cómodo, refugio móvil eficiente de energía. Calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) sistema se utiliza para las unidades centralizadas y temperatura controlada. En general, el diseño de las unidades de laboratorio minimiza el consumo de energía por el uso de sus propias fuentes de energía alternativa como paneles solares y un generador eléctrico independiente. Cada unidad incluye un lavabo y estación Lavaojos, energía eléctrica y conexiones de agua (Figura 3A-C). La plataforma de las TIC ofrece un opcional, basado en el tablet (phone/Tablet Android o iPhone/iPad) documentación de aplicación para el seguimiento de la fuente y documentación del resultado de laboratorio (figura 3D) desarrollado en colaboración con la tecnología de información de Baylor (IT) Grupo de investigación que es bien experimentado en el trabajo en entornos remotos con conectividad limitada. El sistema puede funcionar mediante señales de celulares o inalámbricas y permite documentación sin conexión, con copia de seguridad inmediata o transmisión a un servidor basado en nube segura cuando la conexión se restablece.

El laboratorio cuenta con varias características clave de control de infecciones, incluyendo: (a) negativo de presión flujo, (b) una caja de guante o bioseguridad gabinete, (c) una gestión de riesgos de salud sistema de aire: un germicida ULTRAVIOLETA (UV-C) alumbrado usando 4 jerarquías de defensa probada para eliminar el 99,7% de los patógenos causantes de infecciones relacionadas con el cuidado de la salud. La instalación se desinfecta fácilmente utilizando peróxido de hidrógeno o hipoclorito de sodio (lejía) sistemas de descontaminación eficiente y eficaz. 16

El aseguramiento de la calidad de resultados de laboratorio depende de un compromiso para evaluar todos los aspectos del proceso de pruebas de diagnóstico conjunto. Aquí, presentamos una lista de control para el flujo de trabajo de laboratorio BSL-2 y BSL-3 y un protocolo para prueba de diagnóstico rápido de virus respiratorios. El proyecto diagnóstico de enfermedades virales se basa en la detección de ARN o del ADN viral en muestras (lavado nasal, sangre, heces y orina, etc.) a través de la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR). La habilidad para estimar rápidamente la carga viral en una muestra hace PCR una herramienta eficaz para la enfermedad viral detección17,18. La aplicación de la novela, ensayos de diagnóstico moleculares permite la expansión de las capacidades de diagnóstico para virus como el Ebola19,20,21,8,de influenza22y tuberculosis (TB )23.

El objetivo de este trabajo es validar una instalación del nuevo laboratorio modular y despliegue rápido y proporcionar a una guía de entrenamiento para el personal de laboratorio trabajan en entornos remotos, de bajos recursos durante una epidemia, desastre natural u otra emergencia situación. Aquí, presentamos un protocolo para el diagnóstico de gripe respiratoria en este laboratorio portátil, innovador.

Protocol

1. instalación Nota: Sólo 2-4 personas se necesitan para implementar la unidad de laboratorio “tipo Lego”. Óptimamente, 4 individuos se utilizará para implementar, pero es posible con tan sólo 2. Utilizar una carretilla elevadora (figura 1A,B) u otro dispositivo de elevación adecuado para manejar el contenedor. Utilizar una carretilla elevadora con al menos siete toneladas de capacidad de elevación para manejar los dos tipos de contenedores24. Para configurar una unidad de laboratorio, seleccionar un patch de aproximadamente 90 x 60 pies cuadrados (27,4 x 18.3 m2) sobre un paisaje plano para asegurar que no haya obstáculos dificultan la disposición apropiada. Asegúrese de que el sitio cuenta con suelo bien drenado para asegurar drenaje del sitio ya que esto puede causar problemas con la disipación de agua después de la lluvia caída. Uso de terrenos que han sido previamente nivelado y que suelo duro compactado de una resistencia a la compresión mínima de 10 kN/dm2. El área circundante debe permitir el acceso al equipo necesario para la descarga de la unidad de su dispositivo de transporte y acomodar el equipo de apoyo necesario para realizar la tarea. Coloque la unidad o unidades en su ‘modo de transporte’ en el centro del sitio elegido y ajustar el nivel. Cada unidad está equipada con cuatro tomas de nivelación para permitir la implementación en un sitio que tiene un grado máximo de 6.5% (~ 4 grados). La elevación mínima de los contenedores es ~ 6 pulgadas para asegurarse de que los drenajes en el piso y tubos de descarga funcionan correctamente. No se extienden tomas de más de 12 pulgadas. Conecte el soporte al brazo del gato. Asegúrese de que el contenedor esté nivelada colocando un nivelador de burbuja en el centro de cada travesaño. ¡No se expande la unidad hasta que se ha posicionado correctamente! Ampliar la unidad con la apertura de los paneles para funcionalidad completa. Primero Localice la varilla de soporte de dos piezas. Conecte la varilla de soporte para que su altura es casi tan alta como la unidad de envase. El polo permite al usuario abrir el panel y soportar el peso del panel del techo, las puertas se abren. Hay un clip de seguridad que actúa como un pin para mantener los paneles bloqueados. Retire el gancho de seguridad en primer lugar, luego levante y saque el pasador de bloqueo de leva del agujero. Colocar el pasador detrás de la palanca y alejados de la palanca de bloqueo de levas ubicadas a los costados (ampliable) parte inferior del envase. Elevar el techo de Panel de 1, considerando que este panel tiene gas struts y una vez abiertas las puertas de panel, los puntales se suelte. Esto permitirá que el usuario Levante el techo (Panel 1) utilizando la varilla de soporte de dos piezas. Mueva la punta de la varilla de soporte bajo el panel del techo para que lo apoyen temporalmente (Figura 4A). Mientras que la explotación hasta el panel del techo con el poke ayuda, encontrar la cadena de seguridad, situado en la parte superior izquierda del contenedor. Con la ayuda de 2-3 personas, cuidadosamente arrastre hacia abajo el Panel 2 hasta que la cadena de seguridad es recta, sosteniendo el peso del panel 2 y se ha involucrado. Para conectar el cinturón de correa de cabrestante para el montaje de la zapata con la mano enrollándola alrededor de la parte exterior del puntal del gas. Nota que si no hay ninguna herramienta de torno, el paso anterior puede completarse manualmente con al menos dos personas a cada lado del panel de la tenencia y bajar manualmente.PRECAUCIÓN: El peso del panel es de 260 libras! Asegurar que no existen personas o elementos en forma de Panel 2 y usar el cabrestante y taladrar, proceder a bajar el panel (Figura 4B). Al Panel 2 está completamente bajado, desconecte el torno correa y carrete nuevo en el torno. Quitar el cabrestante y colocarlo en el lado opuesto del contenedor en preparación para el uso. Ambos lados de la unidad son idénticas y siguen los mismo pasos anteriores para el otro lado de la unidad. A la implementación completa del primer lado, llegan al Panel (que es actualmente el piso) y con al menos dos personas a cada lado, manualmente Levante 3 Panel en su lugar como la puerta y la pared frontal de la cara (figura 4). Las dos personas seguirán siendo para Panel de 3, mientras que la tercera persona quita la varilla de soporte.PRECAUCIÓN: no debe estar dentro de la unidad o debajo de la azotea hasta el 3 de Panel de pared en lugar! Desde el interior del Panel 3, ubique los dos pestillos y bloquear en su lugar usando la correa de seguridad. Asegúrese de que las juntas de goma del panel de techo negro se tiran hacia fuera hacia el interior de las unidades. Esto debe hacerse para evitar la lluvia y otros penetración del agua en la unidad. Desde el interior del contenedor, desbloquear Panel 4. Una vez desbloqueado, empuje el Panel 4 (figura 4) que abre como una puerta. Seguridad de la cerradura los dos cierres dentro de la pared. Desbloquear Panel 5 y repita los mismos pasos para Panel 4. Fije este Panel con cierres de seguridad interna misma. Una vez que el interior de toda la unidad se ha bloqueado, vuelva a apretar el torniquete hasta el piso y paredes laterales están selladas. Una vez que ambos lados del recipiente se expanden con seguridad, revise los conectores y hacer los ajustes necesarios de desplazamiento que puedan haber ocurrido. Compruebe el refugio para estar a nivel semanal. Después de condiciones climáticas extremas (lluvia o viento) Inspeccione gatos en recipientes y ajustar en consecuencia. Ampliar el segundo envase si los módulos de laboratorio conectable se planean para su uso (figura 5). Conecte las unidades de fuente de alimentación y suministro de agua. Una instrucción detallada sobre la instalación de un generador diesel conectado a las unidades a través de una caja de interruptor puede encontrarse en el manual según24.Nota: La unidad de laboratorio remoto se implementa ahora. El volumen no plegables interior de la unidad permite para almacenar mínimo de la fuente de laboratorio y equipo necesaria para pruebas de diagnóstico particular. Instalación de sistema de presurización para BSL-3 módulo se describe en detalle24 y requiere control adicional de calidad. 24 2. lista de verificación para protección de personal y flujo de trabajo de laboratorio básicos Nota: Un error en cualquiera de los generales de seguridad y las fases de la exigencia de pruebas de laboratorio puede invalidar los resultados de todo el proceso de prueba. Antes de prepararse para entrar en la unidad de laboratorio instalado, asegúrese de que los requisitos de seguridad BSL-2 o BSL-3 se contabilizan: vestirse con equipo de protección personal apropiado (PPE), lavarse las manos, con guantes y descontaminación de los espacios de cualquier trabajo que se para ser utilizado. Siga la lista en la tabla 1 que contiene los requisitos de seguridad para la protección personal durante las pruebas en el laboratorio BSL-2 y el módulo de BSL-3 (la caja de guante montado sala – presión negativa y PCR sala – presión positiva). Descontaminación de todos los suministros en el laboratorio y espacio de trabajo. Si planea utilizar solución de hipoclorito de sodio (0.5%), también conocido como líquido blanqueador, para descontaminar el espacio de trabajo y suministros, también utiliza etanol al 70% para limpiar todas las áreas expuestas para blanquear, como blanqueador puede mezclarse con otros productos químicos en el espacio de trabajo para crear vapores tóxicos. Deseche todos los productos de cloro en su propio cubo de basura designado. Antes de comenzar a trabajar en la unidad de laboratorio, conocer su disposición y el diseño. Reglas estrictas para el procesamiento de las muestras en la sala de la caja de guante (GB). ¡La habitación de GB es presión negativa! Para operar una caja de guantes, verifique las instrucciones del fabricante. Varias fuentes proporcionan tutoriales detallados sobre guantera operación25.Nota: El propósito de este ensayo es extraer y purificar el ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), si está presente, de las muestras. El ARN/ADN extraído se ensayarán por una RT-PCR en tiempo real para detectar la presencia o ausencia de patógenos virales específicos – influenza (INF). 3. diagnóstico de virus de gripe rápida por RT-PCR en una instalación de laboratorio BSL-2 Recibir y registrar Solicitar la lista de verificación de EPI (ver sección 2). INF es un agente de clase 2 que requieren práctica BSL-2. Se requiere el PPE apropiado para la práctica de BSL-2. Además, use gafas de seguridad y batas de laboratorio manga con manguito para minimizar la exposición potencial de la piel. Según la Organización Mundial de la salud (OMS) las recomendaciones26, Utilice torundas de rayón o dacrón estéril con ejes de plástico para toma de muestras del tracto respiratorio.Nota: Algodón o hisopos de alginato de calcio o hisopos con palos de madera pueden contener compuestos que inactivan algunos virus e inhiben la polimerización en cadena prueba26,27. Frotis de la muestra se toma de los pacientes, transportarlos a las instalaciones del laboratorio de campo o clínica. Transferir las muestras a través de la ventana de paso; esta ventana no puede abrirse por ambos lados. En la ventana de paso, tubos de aerosol que contienen las muestras con lejía durante 1 min seguido por etanol al 70% y secar para proporcionar adecuada descontaminación antes de entrar en la unidad de laboratorio. Después de la sumersión, el técnico de laboratorio dentro de la unidad se abra la ventana paso y recolectar las muestras del recipiente por la lejía a registrar. Generalmente, la persona pasa la muestra y la extracción de la muestra no son lo mismo. Abra la ventana paso y recolectar las muestras para ser registrado. Limpiar las muestras que fueron desinfectadas en lejía y etanol. Limpie el interior de la ventana de paso a través con cloro seguido de solución de etanol 70%. Registrar una muestra dentro de sistema interactivo basado en la tablet o un portátil. Identificar una muestra con la siguiente información:-Fecha colección-Fecha de inicio-Sexo y edad paciente-Tipo de muestra (por ejemplo., torunda nasal)-Identificadores únicos-Otra información pertinente Utilizar códigos de barras para el etiquetado de los tubos. Añadir código de barras a cada tubo de muestras y cuatro tubos de vacíos para alícuotas. Mover las muestras a la campana de ventilación. Escanear un código de barras en cada tubo y asegúrese de que la información de identificación adecuada de la muestra aparece en la pantalla de sistema u ordenador portátil basado en la tableta. Si no hay códigos de barras, utilice un marcador resistente al alcohol. Siempre marcar el frasco en sí mismo, nunca puede conseguir cambiar la tapa como esta durante la manipulación. Completar el proceso de registro. Alícuota de la muestra Tubos de ensayo una vez han sido etiquetadas, usar un gabinete de bioseguridad clase 2 certificado para manejar muestras y hacer alícuotas de muestras. Una alícuota se puede utilizar para pruebas inmediatas y los demás retenidos para fines de referencia o repetición de pruebas. Muestras llegan con la punta de la torunda nasal en el medio de transporte viral, levantar la punta de la torunda en el medio de 30 s y apriete contra el lado de la cubeta. Luego lo quite del medio y con un protocolo de residuos biopeligroso (apropiadamente descartar, autoclave o colgar en solución de cloro al 1: 100).Nota: El menor volumen de medio que debe ser almacenado es de 0.5 mL. Por lo tanto, una muestra de 3 mL puede dividirse en seis partes alícuotas (submuestras). Utilice tubo de cryo-almacenamiento de 1 mL para cada muestra de 0,5 mL para proporcionar volumen extra medio congelado. Cuando se toma alícuotas, utilice pipetas estériles o desechables frescos para cada muestra y deshacerse de ellos en contenedores de residuos biosanitarios hospitalarios con el fin de evitar la contaminación cruzada. Asegúrese de que cada tubo herméticamente sellada y cerrada. Utilizar una alícuota por muestra para la extracción inmediata y almacenar cualquier otras alícuotas en el freezer (-80 ° c ya que es una muestra respiratoria) para uso futuro. Antes de trasladarse a la estación de trabajo, limpie todas las superficies de trabajo y equipo con cloro seguido de solución de etanol al 70%. Extracción y purificación Para asegurar la calidad de prueba, mueva el código de barras de la PCR muestra alícuotas de muestra manejo de área de la estación de trabajo (cabina de seguridad BSL-2) designada para la extracción. Este gabinete de seguridad tiene un conjunto independiente de pipetas para la manipulación de la muestra. Utilice el kit mini viral de RNA para la extracción de muestras de RNA. Siga las instrucciones del fabricante para la purificación del ARN viral por protocolo de vuelta. Preparar mezcla principal según el número de muestras que deban ser extraídos. Mantener la mezcla principal de muestra y lysis buffer a temperatura ambiente. Preparar el número de muestras que deban ser extraídos. Etiqueta 1.5 mL tubos de microcentrífuga con los números de código de barras o identificador único. La pipeta a 560 μl. aplican una pipeta limpia. Añadir 560 μl del buffer de lisis a cada tubo rotulado. Descarte la punta. Aplicar una pipeta limpia. Añadir 140 μl de la muestra. Deseche el viejo y aplicar una pipeta limpia. Repita con la otra muestra. Aplicar una pipeta limpia. Añadir 140 μl de tampón de a tubo de control negativo. Cerrar bien cada tubo. Pulso-vortex de la muestra alícuota 1 con el tampón de lisis para 15 s. repetición con alícuota de la muestra 2 y el tubo de control. Microcentrífuga cada muestras durante 5 s. Incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 min de incubación, volver a centrifugar los tubos para eliminar las gotas del interior de cada tapa de tubo. Añadir 560 μl de solución de etanol a la muestra. Cambiar la punta de la pipeta. Repita con las muestras restantes o adicionales. Cierre cada tubo de muestras bien y pulso-vortex cada muestra para microcentrífuga s. 15 las muestras durante 5 s. Aplique la mezcla a la columna de vuelta. Obtener limpio 2 mL tubos de recogida. Añadir columnas spin y etiquetarlos para que coincida con las muestras. Transferencia de 630 μl de la muestra a la columna correspondiente, en consecuencia. Asegure las tapas y pasar a la centrifugadora. Distribuir uniformemente las muestras en la centrifugadora. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min quitar el tampón de lisis. Volver a la estación de trabajo. Reemplazar tubos de recogida. Añadir el tampón de lisis restantes y repita el paso de centrifugación. Deseche los tubos alícuota original. Desechar el eluido y lavar la columna de giro con dos tampones. Aplicar 500 μl de Buffer AW1. Repita con cada muestra. Asegurar los casquillos de cada muestra y centrifugar a 6.000 × g durante 1 minuto. Repita con el segundo Buffer AW2 y centrifugue a 20.000 x g durante 3 minutos. Finalmente eluir el RNA mediante la adición de tampón de elución. Coloque la columna en un tubo limpio de 1.5 mL, abrir la columna y agregar 60 μL de Buffer Av. incubar a temperatura ambiente durante 1 min y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto. Las muestras están ahora listas para análisis de PCR. Detección y amplificación de la polimerización en cadena Realizar la amplificación por PCR en un área separada para PCR. Realizar la amplificación por PCR del objetivo viral mediante PCR protocolo para un procedimiento de pasos según las instrucciones del fabricante. Tenga en cuenta que una mezcla principal se realiza utilizando iniciadores específicos virales, sondas, 2 x RT-PCR buffer y enzima de RT-PCR. Añadir la mezcla principal a las placas o tubos y añadir y mezclar las muestras individuales (ver sección 4.4). Transferir la placa a la máquina de la polimerización en cadena y ejecutar según las condiciones de amplificación viral objetivo. Una vez que las muestras se cargan en el instrumento PCR tarda aproximadamente 90 minutos para completar la carrera. Mantenimiento después del uso de equipo Realizar el mantenimiento regular y periódico después del uso de equipo según la tabla 2. 4. diagnóstico de virus de influenza rápido por RT-PCR en una instalación de laboratorio BSL-3 Nota: Las condiciones BSL-3, el protocolo experimental permanecerá igual, pero las medidas de seguridad tendrá prioridad sobre cualquier otra cosa. Antes de entrar en el laboratorio BSL-3, mire por la ventana transparente para asegurarse que la presión negativa se ha establecido en la unidad de la caja de guante. Es evidente que la presión negativa se ha establecido cuando una bola rosa en una pared visible. Recibir y registrar Una vez establecida la presión negativa, abra la puerta y entrar en la unidad. Lávese inmediatamente las manos y luego continuar con el PPE. Aplicar la lista de verificación para la PPE y flujo de trabajo de BSL-3 (ver sección 2). Proceder a colocarle el PPE en el siguiente orden: bajo guantes de vestido, cubiertas del zapato, mascarilla, careta, segundo par de guantes. Se recomienda usar un vestido completo que protege todo el cuerpo. Encienda la máquina y permitir la presión en la guantera para estabilizar. Utilice una solución de rociado lejía para descontaminar todas las áreas y fuentes a utilizar dentro y fuera de la caja de guante. Disponer de residuos de lejía en un recipiente sólo blanqueador. Se ha utilizado solución de etanol al 70% de uso de limpiar todas las áreas para el blanqueador. Transferir la muestra a través de la ventana de paso a través.Nota: Antes de haber caído en el paso a través de la ventana, desinfectar los tubos que contienen las muestras por sumergirse en un baño de hipoclorito durante 1-2 min particularmente, rocíe las muestras con una solución de lejía y dejar solo para al menos 1 minuto y paso antes de recibirlos dentro de la unidad de BSL-3. La persona pasa la muestra de fuera y la persona que recibe, extracción de la muestra dentro de laboratorio BSL-3 no debe ser el mismo. Recibir las muestras dentro de la unidad de BSL-3 y limpiarlos antes de proceder a la inscripción y medidas de etiquetado. Registrar una muestra con el sistema interactivo de tableta o un ordenador portátil. Identificar una muestra con la siguiente información (ver apartado 3.1.5). Utilizar códigos de barras para el etiquetado de los tubos. Si no hay códigos de barras, utilice un marcador resistente al alcohol.Nota: Siempre marcar el frasco en sí mismo, nunca puede conseguir cambiar la tapa como esta durante la manipulación. Alícuota de la muestra Una vez que las muestras están registradas y ha sido etiquetado como tubos, coloque las muestras en la guantera certificada a través de la bandeja cerrada de aire para recuperar las muestras del interior de la caja de guante. Cierra la puerta. A continuación, abra la otra puerta a través de la guantera para recuperar las muestras. No abra ambas puertas a la vez. Abra y cierre cada puerta en dos pasos diferentes para las precauciones de seguridad. Encender la luz UV-C. Una vez que las muestras han sido trasladadas con seguridad al interior de la guantera, siga los pasos descritos anteriormente para la creación de alícuotas de la muestra en una caja de guantes. Una alícuota de muestra puede utilizarse para las pruebas de inmediato y los demás retenidos para fines de referencia o repetición de pruebas. Muestras llegan con la punta de la torunda nasal en el medio de transporte viral. Tomar a muestras y poner uno en cada frasco. Revolver la punta del hisopo en el medio de 30 s y apretar contra el lateral del frasco antes de retirar del medio y desecharlo utilizando un protocolo de residuos biopeligroso (apropiadamente descartar, autoclave o colgar en solución de cloro al 1: 100).Nota: El menor volumen de medio que debe ser almacenado es 0,5 mL, frascos de 1 mL de uso para este propósito. Por lo tanto, una muestra de 3 mL puede dividirse en seis partes alícuotas (submuestras). Utilizar pipetas estériles o desechables frescos para cada muestra y desecharlas como residuos biopeligrosos. Una vez las muestras son alícuotas, mover las muestras en recipiente hermético. Cerrar los frascos con protección y saque de la caja de guante. Dentro de la guantera, cierre la bolsa de residuos de riesgo biológico y preparar una nueva bolsa de residuos para evitar la contaminación cruzada. Descontaminar el espacio de trabajo de guantera aplicar cloro durante 5 minutos y solución de etanol 70% luego. Utilizar una alícuota por muestra para un análisis inmediato y otros conservar en congelador a-80 ° C ya que es una muestra respiratoria. Después de descontaminación conservar una alícuota para la prueba, mueva todas las muestras de la guantera para el almacenamiento en congelador de-80 ° C. Extracción y purificación Después de la descontaminación, mueva las alícuotas de muestra de código de barras necesarias para análisis por PCR de la muestra de manejo de área en la caja de guante. En la guantera, realice todos los pasos de lisis para el procedimiento de extracción. Utilice el kit mini de RNA viral para extracción de muestras de RNA según las instrucciones del fabricante. Siga las instrucciones paso a paso para la purificación del ARN viral por protocolo de vuelta en las instrucciones del fabricante. Preparar el número de muestras que deban ser extraídos. Etiqueta 1.5 mL en tubos de centrífuga micro con los números de código de barras o identificador único. Añadir 560 μl del buffer de lisis a 140 μl de la muestra y pulso vortex. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.Nota: El procedimiento de inactivación puede variar dependiendo del tipo de patógeno de BSL-3 que está siendo extraído y en algunos casos inactivación adicional puede ser necesaria. Después del paso de lisis, bien sellar las tapas de cada muestra y coloque en el paso de aire bloqueado (si la centrifugadora está ubicada fuera de la caja de guante). Transferir las muestras sometidas a lisis en bioseguridad en gabinete para el resto del procedimiento.Nota: El procedimiento para la extracción y purificación de RNA puede ser completado en la guantera o en una caja de guante seguido por el gabinete de seguridad biológica dependiendo del patógeno de BSL-3 y protocolos necesarios. Asegúrese de que descontaminar el espacio de trabajo y en la guantera con lejía, y solución de etanol 70% para limpiar todas las áreas expuestas anteriormente para blanquear. Siga los pasos en la sección 3.3.6 – 3.3.10 para lavado y purificación del ARN. Después de la extracción, transferir las muestras a la ventana de paso para el análisis PCR. Después de las muestras ha sido removido y transferido, descontaminar el espacio de trabajo de laboratorio fuera de la caja de guante, según la sección 2. Antes de retirar del PPE esperar una circulación de aire en la unidad con seguridad ha alcanzado el número adecuado de ciclos antes de comenzar a quitar el PPE de filtración. Inmediatamente después de la extracción y eliminación de los EPI en el PPE recipiente para residuos, proceder a lavarse las manos en el laboratorio con agua y jabón antes de salir la unidad, según la sección 2. Detección y amplificación de la polimerización en cadenaNota: La amplificación de PCR se realiza en un área separada designada para PCR y conectado con la zona de guantera via ventana de paso a través. El espacio de trabajo y los suministros tienen que ser descontaminados antes de una prueba. Eliminar las muestras de RNA extraídas de la ventana de paso a través. Realizar la amplificación por PCR del objetivo viral utilizando el protocolo PCR de un solo paso. Preparar una mezcla maestra utilizando iniciadores específicos virales, sondas, 2 x RT-PCR buffer y enzima de RT-PCR. Utilizar un tubo de 1,5 mL con los siguientes componentes para cada ensayo objetivo: agua, cebadores y sondas, tampón x 2 enzima RT-PCR. Mezclar y hacer girar la mezcla principal. Parte alícuota de la mezcla principal en cada uno de los tubos de la tira. Devuelva el kit PCR a almacenamiento a la temperatura recomendada una vez que se ha preparado la mezcla principal. Añadir las muestras individuales a cada uno de tira tubos usando una punta separada entre cada tubo de tiras. Gire la placa de la muestra o tubos a 1.500 rpm durante 1 minuto. Las muestras están listas para ser cargados en la unidad PCR en tiempo real. Transferencia de la placa con las muestras en el instrumento PCR y haga funcionar la máquina según las condiciones de amplificación viral objetivo. Tarda aproximadamente 90 minutos para completar una carrera. Antes de recoger los resultados y dejar el laboratorio, retire del PPE y descontaminar adecuadamente cada estación de trabajo y la preparación para la siguiente prueba diagnóstico, según la sección 2. Mantenimiento después del uso de equipo Realizar el mantenimiento regular y periódico después del uso de equipo según la tabla 2.Nota: El tiempo global de diagnóstico es aproximadamente 4 horas. Tiempo de extracción y PCR tiempo pueden variar dependiendo del número de muestras y la prueba de diagnóstico puede tomar 4-5 horas o más, respectivamente.

Representative Results

El objetivo de este estudio es demostrar que las instalaciones de laboratorio móvil BSL-2 y BSL-3 propuestas proporcionan un ambiente adecuado que permite virus respiratorio pruebas diagnósticas con resultados representativos idéntica a pruebas realizadas en alta calidad Laboratorios fijos. Las instalaciones del laboratorio están diseñadas para cumplir con los requisitos de la prueba dados en las recomendaciones de salud ocupacional y seguridad (OHS). Tan pronto como la instalación de laboratorios remotos es desplegada (figura 4) y todo el equipo y suministros están instalados (figura 5), se pueden ejecutar pruebas de laboratorio. Según laboratorio procedimientos operativos estándar, PPE (batas de laboratorio, calzado de seguridad, guantes, avanzada de la mascarilla, gafas protectoras, etc.) apropiado para práctica de BSL-2 se requiere. Práctica BSL-3, el módulo de laboratorio PCR de presión negativa está equipado con una caja de guante certificada. Las unidades de laboratorio se actualizan por windows paso externos para proteger al personal en la etapa de recepción de la muestra. El proceso de registro se puede simplificar con la aplicación previamente desarrollada de tableta (figura 3D). Otras aplicaciones aceptables que se ejecutan en un ordenador portátil se pueden utilizar también. Esta prueba de diagnóstico de virus respiratorios en particular se puede realizar en los módulos de laboratorio conectados para separar los pasos del procedimiento de diagnóstico a propósito para evitar contaminación o potencial interferencia entre reactivos bioquímicos, que pueden afectar la resultados de la prueba. Para maximizar la calidad del diagnóstico, la práctica de la prueba de diagnóstico rápido utiliza (i) tanto el laboratorio básico BSL-2 y la habitación PCR de travesía conectado (sección 3) o (ii) las habitaciones GB y PCR conectadas por ventana de paso a través (sección 4). El diagrama de flujo de trabajo de laboratorio propuesto se presenta en la figura 6 y enfatiza la protección personal. El esquema reconoce la importancia de cada paso indicado para la protección del personal, especialmente si el personal de laboratorio en áreas remotas es mínimamente entrenado. La prueba de diagnóstico rápido de influenza se logra mediante la técnica de RT-PCR. El procedimiento contiene cuatro pasos principales. Tenga en cuenta que los espacios de trabajo individuales se asignan para cada etapa del protocolo. El primer paso es obtener una muestra y subdividir en varias alícuotas. Las alícuotas pueden ser marcadas con códigos de barras para mejorar la eficacia del control de datos y almacenadas en el congelador para posteriores investigaciones. El segundo paso es desactivar una muestra en tampón de lisis por centrifugación y calefacción. Los pasos primeros y segundo deben llevarse a cabo en gabinetes de bioseguridad. Utilizar la pipeta individual y aparatos. Se propone una prueba PCR que se realizará en la sala de la polimerización en cadena, si está disponible. El tercer paso es la documentación de los resultados. Paso cuatro es el mantenimiento después del uso del equipo y recordatorio de la protección personal al final del experimento. Si la muestra debe ser clasificado como BSL-3 + (e.g.,Ebola, Zika, MERS, TB) la instalación de la caja de guante debe ser utilizada. En el laboratorio, la sala de GB tiene su propia ventana de paso a través para recibir muestras y un ordenador portátil o tablet para el registro de la muestra. La alícuota de muestra y la inactivación del virus deben realizarse en el compartimiento de la guantera. Luz UV-C se recomienda para evitar la contaminación durante el procedimiento. Después de la inactivación de una muestra, más pasos de protocolo son similares a los del laboratorio básico BSL-2 y BSL-3 test y sigue lista parte III (tabla 1, figura 6). Figura 1. Prototipo de laboratorio centro. (A, B) Modo de transporte; (C) modo de desplegar: exterior; (D) modo de desplegar: interior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 . Esquemas. (A) del laboratorio básico BSL-2; (B) módulo de la BSL-3 incluye la guantera y laboratorios de PCR, que tienen una ventana de paso común para la transferencia del espécimen protegido; (C) laboratorios conectado (A) y (B) con servicios compartidos. (D,E) Fotografías de los aparatos conectados desde lados opuestos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 3. (A) Interior de las instalaciones del BSL-3 tiene (1) una ventana de paso, un fregadero y (2) una estación de lavaojos en la entrada; (B) conectores de corriente eléctrica, conectores de agua (C); (D) software basado en la tableta para suministro de resultado de laboratorio y seguimiento de documentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 . Implementación de las instalaciones del laboratorio. Instrucción para los paneles de despliegue en un lado de la unidad como se muestra (A, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 5 . Esquemas del laboratorio conectable: (A) BSL-2 módulo 1; Modulo de guantera (B) y la PCR 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 6 . Diagrama de flujo para una prueba de RT-PCR diagnóstico de virus respiratorios en las instalaciones del laboratorio remoto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Laboratorio remoto BSL-2 Laboratorio remoto BSL-3 Parte I Parte I i. tecnología de laboratorio entrar por la puerta con la etiqueta de entrada y en bata de laboratorio, que cuelga en la rejilla junto a la puerta de entrada. Están prohibidos los zapatos abiertos, avanzada de la mascarilla y gafas protectoras se anima. i. tecnología de laboratorio buscar en la ventana de la caja de guante de fuera de la unidad para asegurar la presión negativa se activa. (Bola rosa debería ser visible en la unidad para mostrar que la presión negativa está funcionando). II. laboratorio lavarse las manos en el fregadero, colóquese guantes desechables y comenzar con la toma de muestras. II. Si la presión negativa está funcionando, tecnología de laboratorio entra por la única puerta y ponerse la bata de laboratorio, que cuelga en la rejilla junto a la puerta de entrada.  Están prohibidos los zapatos abiertos, avanzada de la máscara y gafas protectoras son deseables. III. las muestras que se sumergieron en el baño de hipoclorito antes de haber caído en la ventana de paso a través se sientan en paso a través de tecnología de laboratorio. III. laboratorio lavarse las manos en el fregadero, colóquese guantes desechables, PPE y comenzar con la toma de muestras. IV. recibido en la recepción de la muestra. IV. las muestras que fueron previamente sumergidas en baño de hipoclorito antes de haber caído en el paso a través de la ventana están sentados en paso a través de tecnología de laboratorio. Parte II v. recibido en la recepción de la muestra. v. según el procedimiento de diagnóstico, las muestras se trasladó a gabinete de bioseguridad e inactivo. Parte II VI. las muestras preparado para microscopia, centrífuga o pudriciones. VI. las muestras inactivadas en guantera. ejecutan pruebas diagnóstico VII. adecuadas. VII. las muestras para aislamiento de ácidos nucleicos. VIII. almacenar las muestras en 4° C refrigerador o congelador apropiada. VIII. después de la extracción, las muestras se trasladó a paso ventana. Parte III tecnología IX. laboratorio entra a través de la entrada en lateral de la polimerización en cadena de unidad (presión positiva). IX. usar el fregadero para tinción y lavado de artículos. x. tecnología de laboratorio para poner en bata del estante junto a la entrada, lávese las manos en el fregadero, colóquese guantes. x. utilizar laptop & counterpace para realizar análisis y documentación. XI. recibir las muestras de guantera habitación en ventana de paso a través. XI. esterilizar el equipo mediante la ejecución de autoclave. XII. Si muestras necesarias preparado en gabinete de Flujo Laminar. XII. disponer de los residuos con riesgo biológico en el contenedor de residuos de riesgo biológico. ejecutan pruebas de diagnóstico XIII. apropiado. XIII. Lávese las manos en el fregadero. XIV. almacenar las muestras en 4° C refrigerador o congelador apropiada. XIV. colgar bata nuevamente sobre la rejilla. Parte III XV. salir por la misma puerta. XV. utilizar el fregadero para tinción y lavado de artículos. XVI. utilizar laptop & counterpace para realizar análisis y documentación. XVII. transferencia de viales en la ventana de paso a la habitación PCR y esterilizar equipo ejecutando el autoclave. XVIII. desechar los residuos con riesgo biológico en el contenedor de residuos de riesgo biológico. XIX. Lávese las manos en el fregadero. XX. salir por la misma puerta de entrada. Tabla 1. Lista de verificación para el flujo de trabajo de diagnóstico PCR. Mantenimiento y calibraciones Sistemas PCR en tiempo real Mensual Realizar calibraciones de fondo cada mes 18 meses Realizar fondo espacial y calibraciones del tinte cada 18 meses deth Centrifugadora 1 año Calibrar para las revoluciones por minuto y temperatura a través de servicios de calibración interna o externa Caja de guante Diario Inspeccione visualmente los elementos, particularmente por los daños a las superficies expuestas de los filtros HEPA, guantes, empaques y mangueras. Asegúrese de que las abrazaderas de conducto son ajustadas y en su lugar. Realizar prueba de presión de fuga. Prueba de la alarma de presión. 6 meses Cambiar el filtro HEPA 1 año Calibrar el sistema Autoclave Semanal Limpiar el tanque de agua y rejillas con un detergente suave no abrasivo 3 meses Calibrar el contador de tiempo e indicadores 1 año o cada 50 ciclos Inspeccionar, limpiar, probar y calibrar Refrigerador y frigobar 6 meses Comprobar las bobinas del evaporador motor, ventilador, aspirar filtros de condensador y bobinas de condensación y reemplace las pilas según sea necesario 1 año Calibrar el congelador a través de servicios de calibración interna o externa Tabla 2. Mantenimiento de equipo de PCR en tiempo real. Obligatorio Recomienda Bata de laboratorio, calzado de seguridad, guantes Bata de laboratorio, calzado de seguridad, guantes, mascarillas, gafas Refrigerador 4 ° C, congelador-20 ° C Refrigerador 4 ° C, congelador-20 ° C, congelador de-80 ° C Un juego de pipetas automáticas Tres sistemas de pipetas automáticas Centrífuga, agitador, termociclador Sistema robótico Máquina de RT-PCR, baño de hielo RT-PCR con control de temperatura, sin hielo refrigerador Bolsas de residuos biopeligrosos Autoclave para eliminar residuos de riesgo biológico Tabla 3. Requisitos mínimos para el virus respiratorio de RT-PCR diagnóstico prueba de BSL-2.

Discussion

La instalación de laboratorios remotos descrita anteriormente es logísticamente orientado, ampliable, rápidamente desplegable, multifuncional y en base a conceptos de diseño centrado en humanos que han sido orientados para proteger la eficacia personal y espacio de trabajo de laboratorio. El protocolo detallado de configuración de laboratorio rápido y aislamiento de virus respiratorio seguro y diagnóstico fue desarrollado y presentado.

Equipo óptimo funcionamiento, las unidades de laboratorio deben mantenerse las siguientes condiciones: temperatura de 21 ± 2 ° C, temperatura permitida de 5 a 40 ° C, humedad de 14 ± 5% hr, humedad relativa máxima permitida de 80% RH (sin condensación), y una altitud entre 0 y 2.000 m sobre el nivel del mar.

Consumo de energía es uno de los parámetros más importantes para la gestión de un laboratorio fuera de la red. Para equipo de laboratorio la base, la eficiencia de energía puede variar 15-40%; sin embargo, consumo de energía promedio se estima aquí para ofrecer un servicio adecuado. La tasa más alta de potencia (1.500-2.000 W) se relaciona con el acondicionador de aire, el sistema de la guantera, la máquina PCR y el Esterilizador autoclave. Teniendo en cuenta 8 horas de trabajo intensivo, llevando a cabo el protocolo y 16 horas del laboratorio de control de medio ambiente, el consumo diario de unidades de laboratorio es de aproximadamente 36 kWh/día para BSL-2, unos 43 kWh/día para BSL-3 y 73 kWh/día para la conexión BSL-2/BSL-3 + instalaciones. Para una sola unidad, recomendamos proporcionar una fuente de energía eléctrica con capacidad de poder correr continuo ≥8 kW, oleada/a partir de energía ≥ 10 kW; para la instalación conectada, energía funcionamiento continuo ≥12 kW y a partir la oleada/≥14 kilovatio de la energía. Tenga en cuenta, en las instalaciones del laboratorio BSL-3, que una fuente de energía de copia de seguridad se recomienda evitar apagón accidental y garantizar el trabajo estable de la guantera y el sistema de presión negativa durante una prueba de diagnóstico.

Un generador eléctrico de motor con gasolina es una solución rentable para el suministro de energía de emergencia. Asumen que la eficiencia de combustible de un generador gasolina es aproximadamente 1,5 galones por hora al 100% de carga. Entonces, si el consumo diario promedio es 8 horas de 40% de la carga y 16 horas de carga de 10%, requiere de la unidad de laboratorio BSL-2 o BSL-3 7-9 galones de combustible por día, correspondientemente, y la instalación conectada necesita ~ 15 gal/día.

Las unidades de laboratorio remoto están diseñadas para adaptarse a las capacidades de los sistemas de la apagado-rejilla solar panel. Paneles solares no requieren combustible adicional y puede ser operados con alta productividad en las regiones tropicales y subtropicales de África, Asia y América Latina debido a la alta irradiación solar. En la actualidad, una unidad de un sistema de paneles solares disponibles en el mercado permite un uso diario de energía de hasta 44 kWh/día.

Independientemente del tipo de selección de fuente alternativa de energía eléctrica, electricidad sucia filtros son fuertemente recomendados y previamente en las instalaciones de laboratorio para mejorar la calidad de la energía y proteger el equipo de laboratorio. Mantener el sistema PCR lejos de fuentes de radiación electromagnética, fuerte y sin protección debido a fuerte radiación electromagnética puede interferir con el correcto funcionamiento del dispositivo. También es importante no utilizar el sistema de polimerización en cadena cerca de vibración fuerte fuentes, como una centrífuga o bomba debido a la vibración excesiva afectará el desempeño del instrumento. El equipo de laboratorio sólo puede instalarse en un entorno que tiene contaminantes, como partículas de polvo o virutas de madera. Asegúrese de que la habitación está lejos de cualquier tomas de aire que pueden expulsar partículas de material en los componentes del instrumento.

El uso de agua de laboratorio depende del número de pruebas de diagnóstico ejecutar diariamente y el número de técnicos de laboratorio trabajan en la instalación. Agua libre de nucleasa es necesario para la preparación de los mezcladores durante procedimiento de diagnóstico incluyendo extracción y prueba de PCR y debe ser entregado por adelantado como otros materiales y productos químicos. Al menos 50 mL de agua libre de nucleasa se necesita para ejecutar una prueba de diagnóstico; el volumen requerido de agua libre de nucleasa depende de la carga de trabajo (es decir, el número de muestras). Agua destilada es necesario ejecutar el Esterilizador autoclave. Consumo de agua del autoclave en un ciclo es de 160-180 mL; la autoclave se recomienda para uso diario. La mayoría de los plásticos (tubos, pipetas, etc.) es desechable, pero algunos son reutilizables y necesitan ser lavada (grandes contenedores, estantes, etcetera). Se utiliza agua corriente para lavarse las manos entre los procedimientos y su volumen mínimo se estima que diariamente 15-20 L. El agua debe ser bombeada para presión; sistema de prefiltro de sedimentos se recomienda proteger los aparatos de agua de los efectos dañinos de sedimentos y mejorar la calidad del agua.

Para almacenamiento en frío, por lo menos un 5,1 pies cúbicos refrigerador (+ 4 ° C) y un congelador de 4,9 pies cúbicos (-20 ° C a-30 ° C) se requieren en cada unidad del laboratorio para almacenar muestras / RNA.

Descontaminación del laboratorio incluye varios niveles: limpieza > antisepsia > desinfección > esterilización. Fácil limpieza puede realizarse utilizando agua y jabón y frotando con un cepillo o mano enguantada. La antisepsia incluye lavado con producto químico líquido antimicrobiano para inhibir el crecimiento y la multiplicación de gérmenes. Soluciones de alcohol (70%) puede ser utilizado como un antiséptico líquido. Desinfección es la aplicación de un producto químico líquido para eliminar los microorganismos patógenos casi todos (excepto esporas bacterianas) en las superficies de trabajo y equipo. Tiempo de exposición química, temperatura y concentración de desinfectante son importantes. Solución de hipoclorito de sodio (0.5%), o cloro, es un desinfectante eficaz a gran escala para la purificación del agua y purificación superficial. La irradiación germicida ULTRAVIOLETA es otro método de desinfección. Una lámpara germicida UV-C luz y lleva a la inactivación de bacterias y virus. La esterilización emplea un procedimiento físico o químico para destruir toda la vida microbiana, incluyendo esporas bacterianas altamente resistentes. Puede realizarse la esterilización con un esterilizador de la autoclave.

Todos los desechos de laboratorio deben estar separados en el punto de generación. Residuos sólidos, no aguda, infecciosa lugar en bolsas de basura a prueba de fugas marcan como biohazard. Si los residuos generados es agudo, se colocarán en envases resistentes a la punción. Recoger residuos potencialmente infecciosos líquidos en envases correctamente etiquetados biohazard para líquidos. Bolsas y contenedores no se deben rellenar más de 2/3 del volumen. La disposición de todos los productos blanqueadores debe ser clasificada en su propio cubo de basura designado. Los desechos de laboratorio deben ser manipulado con cuidado para evitar la generación de aerosoles y rotura de bolsas o contenedores. Colección bolsas/recipientes con residuos de riesgo biológico debe ser selladas y externas superficies descontaminadas después de su uso con solución de hipoclorito de sodio al 0,5%. Esterilizar todos los desechos de laboratorio en autoclave a 121 ° C durante 30 minutos antes de la incineración. Consulte el manual de funcionamiento para el uso correcto del autoclave. Si es posible, añadir un indicador químico o biológico a la autoclave para esterilización adecuada. Todos los residuos sólidos y líquidos autoclave deben etiquetarse claramente como esterilizado con el establecimiento, fecha, hora y operador. Luego se colocarán los residuos etiquetado en un área seguro y separado antes de la incineración.

Como era de esperar, flujo de trabajo de prueba de diagnóstico depende de la enfermedad y la muestra. Si se recomienda para que la identificación de virus a obtener muestras de sangre (por ejemplo, Ebola,19), partes alícuotas de la muestra pueden almacenarse a-20 ° C en lugar de-80 ° C (necesaria para virus respiratorios). Siempre es mejor tomar más de un ejemplar al muestreo de un paciente que al subdividir a muestras más adelante. Si es posible, para cada tipo de muestra se debe por lo menos dos muestras en tubos de muestras separadas. Las muestras deben estar subdivididas si muestreo adicional no es posible.

Si muestras alternativas no debe almacenarse a temperaturas adecuadas (por ejemplo, no congeladores están disponibles), hisopos deben almacenarse en puro (100%) etanol o 99% alcohol desnaturalizado (sólo aditivos de metanol). En este caso, se debe poner la punta del hisopo en un frasco con 1-2 mL de etanol. Tenga en cuenta que estas muestras son convenientes solamente para PCR. También, tenga en cuenta que un ensayo bien establecido es necesario para cada virus en particular diagnóstico8,23, y muestras de virus desconocidos deben enviarse a los laboratorios asignados para más investigaciones19,20, 21.

Requisitos obligatorios y recomendados a la lista de equipo de laboratorio para pruebas de PCR diagnóstico virus respiratorio deben ser reconocidos. Tabla 3 pone de relieve básico y mínimamente avanzado equipo (recomendado) y los requisitos para la prueba de diagnóstico de RT-PCR. Para la práctica de BSL-3, protección de presión extra negativa (por ejemplo, guantera) del personal es fundamental y necesario.

Los módulos de laboratorio conectado están preferibles aumentar el número de personal involucrado en las pruebas de laboratorio y acelerar el tiempo necesario para una sola prueba. Sustitución de la extracción de RNA manual desperdiciador de tiempo es posible con qPCR automatizado (por ejemplo, QiaCube). Mientras que este instrumento es engorroso (ancho 65 cm, largo 62 cm, altura de 86 cm), que cabe el espacio de trabajo de laboratorio móvil después de cambio de muebles en BSL-2 o BSL-3 unidades.

Trabajo futuro se centrará en el desarrollo de realidad aumentada (AR) y entrenamiento de realidad virtual (VR). Las gafas de AR/VR se utilizará para proporcionar una plataforma interactiva para enseñar habilidades necesarias para convertirse en un trabajador capacitado del laboratorio. Consejos útiles para realizar algunos de los procedimientos difíciles, varios pasos en pruebas de laboratorio de diagnóstico se incluirán en la guía de software. Este enfoque de formación del personal debe mejorar la calidad de la prueba de diagnóstico de desempeño y gestión en las instalaciones de laboratorios remotos, especialmente remotas y áreas de recursos limitados.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El contenido de este artículo no reflejan necesariamente las opiniones o políticas de la nosotros Departamento de salud y servicios humanos o de las instituciones afiliadas con los autores. Esta investigación fue apoyada por Paul G. Allen Family Foundation “Mejorado cero impacto, Pod inteligente de emergencia”. Agradecemos profundamente todas las discusiones fructíferas y colaboración con los colegas de Baylor College of Medicine, GSS salud, Johnson Space Center de la NASA. Estamos sinceramente agradecidos a Thermo Fisher científicos y sus representantes para un préstamo de la máquina de RT-PCR, centrífuga y pipetas automáticas para llevar a cabo una prueba de diagnóstico de virus respiratorios en las instalaciones del laboratorio remoto. Los autores están agradecidos a Marta Storl-Desmond y Sidney Stephen Sorrell por su ayuda en la preparación del manuscrito y la videografía.

Materials

Autoclave Sterilizer 'BioClave' Benchmark Scientific, Edison, NJ, USA B4000-16 16 liter, Benchtop, Dims: 22×17.5×15.7 in, Fully automatic, Extremely Compact
Barcode Scanner Zebra Technologies ZIH Corp., Lincolnshire, IL, USA Symbol LS2208 Handheld, lightweight
Breaker Box Panelboard Enclosure Square D (Schneider Electric), France  MH62WP  NEMA 3R/5/12, Dims: 20 W x 62 H x 6-1/2 in. D, Electrical distribution board
Centrifuge – Microcentrifuge 17,000 x g Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75002440 Holds 24 x1.5 or 2 ml tubes, Dims: 8.9×9.6×13.8 in
Class II Biological Safety Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-602-400 4 Ft. Class II Type A2 Cage Changing Biological Safety Cabinet, 12" Access Opening, HEPEX Pressure Duct 
Class III Biological Safety Cabinet (Glove box) Germfree Laboratories, Ormond Beach, FL, USA Model #PGB-36, Serial #C-2937 Glove box, Portable, 36", Class III BSC. Dims: 36x20x23.75 in, Includes 2 interior outlets
Cryo Coolers VWR, Radnor, PA, USA 414004-286 0.5 or 1.5 ml tube benchtop coolers
Freezer (30°C freezer) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA Model ULT430A To occupy 4.9 Cubic feet
Laminar Flow Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-126-300 3 Ft. Vertical Laminar Airflow Cabinet, 8" Access Opening, HEPA filter supply, 99.99%
Mini Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75004061 Dims: 4.1×5.0x6.0 in
Pipettes automated VWR, Radnor, PA, USA 05-403-151 Pipet 4-pack (2.5,10, 100 and 1,000μL volume)
Pipettes automated 'Finnpipette' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4700880 Pipet 4-pack (2, 20, 200 and 1,000μL volume), Advanced Volume Gearing(AVG), Ultra durable
Power Generator Cummins Power Generation, Minneapolis, MN, USA C60 D6 60 kW, 60 Hz, 1 Phase, 120/240V, Diesel
Refrigerator BioMedical Solutions, Inc., Stafford, TX, USA BSI-HC-UCFS-0504W Standard Undercounter Refrigerators & Freezers
Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 05LRAETSA  To occupy  5.1 Cubic feet
RT-PCR machine 'Step-one plus' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4376598 Holds 96 samples, Dims: 9.7×16.8×20.2 in 
Vortex Mix Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 88880017TS Dims: 6.1×8.3×3.3 in
Chemicals
AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 4387391
Ethanol Koptec Pure 200 Proof Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA V1001
Nuclease-free Water Ambion, Inc., Carlsbad, CA, USA AM9906
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 52906
SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 11732-088
Disposable
1 mL cryogenic tubes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 03-337-7X 
1.5 mL tubes VWR, Radnor, PA, USA 10025-726
10 µL Filter Tips Neptune, VWR, Radnor, PA, USA Neptune, BT10XLS3
20 µL Filter Tips Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, USA MultiMax, P-3243-30X
200 µL Filter Tips ART, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA ART, 2770
1000 µL Filter Tips Phenix Research Products, Candler, NC, USA TS-059BR
AB custom probes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA N/A Custom probes
Combitips Eppendorf, Hauppauge, NY, USA 89232-972
Integrated DNA Technology (IDT) custom probes and primer IDT N/A Custom probes
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 490003-978 CS
MicroAmp Fast Reaction Tubes (8 tubes/strip) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strip Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4323032
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4311971
Supplies
Biohazard waste bags VWR, Radnor, PA, USA 14220-046 20.3 x 30.5 cm Biohazard bags
Gloves Denville Scientific, Holliston, MA, USA G4162-250 Small, meduim or large Nitrile or latex gloves
Lab coat N/A N/A Customizable
Masks VWR, Radnor, PA, USA 414004-663 Advanced protection mask
Protective shoes N/A N/A Customizable
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Referencias

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Petrova, E. V., Avadhanula, V., Michel, S., Gincoo, K. E., Piedra, P. A., Anandasabapathy, S. Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics. J. Vis. Exp. (146), e59188, doi:10.3791/59188 (2019).
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