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Medicina

Laboratorio remoto gestione: Diagnostica Virus respiratorio

Published: April 06, 2019
doi:
10.3791/59188
, , , , ,
1Baylor Global Health,Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine,Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Un laboratorio rapidamente dispiegabile, fuori-griglia è stato progettato e costruito per le impostazioni globali remote, con risorse limitate. Le caratteristiche e gli aspetti critici dei moduli laboratorio multifunzionale, espandibile e logisticamente avanzata sono esplorati. Una lista di controllo per un flusso di lavoro di laboratorio di base e un protocollo per un test diagnostico virale respiratorio sono sviluppati e presentati.

Abstract

Un uptick nel recente sottolinea pandemie (Ebola, Zika, MERS, influenza, ecc.) la necessità di un più ‘agile,’ coordinata che affronta una moltitudine di problemi che vanno dal trasporto, accesso, strutture, attrezzature e comunicazione al fornitore formazione. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un impianto innovativo, scalabile, logistica avanzata, mobile, laboratorio per le emergenze e le epidemie nelle impostazioni globali di risorse limitate. Utilizzando uno sfondo in operazioni cliniche come un centro medico accademico, abbiamo progettato un modulare, rapidamente dispiegabile BSL-2 e BSL-3 impianto con software di facile utilizzo per il monitoraggio e la gestione di farmaci e forniture in regioni remote durante le epidemie e focolai. Qui, presentiamo le nostre unità di laboratorio di contenitore di spedizione intermodale, mobile, espandibile. La progettazione del laboratorio facilita l’uso di fuori-griglia minimizzando il consumo di energia e consentendo di fonti d’acqua alternativo. Informazioni dell’unità comunicazione (TIC) piattaforma fornisce documentazione basato su tablet (i) facile da usare, (ii) migliorato il monitoraggio dei pazienti e delle forniture e (iii) integrata comunicazione onsite con telehealth built-in capacità. Per garantire la qualità in ambienti remoti, abbiamo sviluppato una lista di controllo per un flusso di lavoro di laboratorio di base e un protocollo per la diagnosi virale respiratoria usando reazione a catena della polimerasi d’inversione-trascrizione (RT-PCR). Come descritto, questo approccio innovativo e globale consente la fornitura di capacità di laboratorio in ambienti globali di risorse limitate.

Introduction

Diagnostica rapida è uno strumento critico nel controllo tempestivo di infezione virale, soprattutto se precoce sintomatologia è indistinguibile da una varietà di malattie di infezione. La recente epidemia di Ebola (2014-2015) in Africa occidentale1,2, le epidemie di virus di Zika (2015-2016) in Asia e America Latina3,4, l’emergere del coronavirus sindrome respiratoria Medio Oriente (MERS) infezioni5,6e le epidemie insolitamente mortale influenza (influenza) (2017-2018) in US7,8 ha scoperto la necessità di strutture di laboratorio rapidamente dispiegabili, che affrontano una moltitudine di problemi di trasporto, accesso, strutture, attrezzature e comunicazione.

Capacità di fuori-griglia (potere autonomo e approvvigionamento idrico, ecc.) è fondamentale nel rurale, con risorse limitate impostazioni globali9,10,11. La nostra esperienza in operazioni cliniche e programmi globali presso il Baylor College of Medicine è stato utilizzato per progettare e costruire un laboratorio mobile contenitore a base con funzionalità per semplificare la distribuzione, configurazione e uso multifunzionale (BSL-2 e BSL-3). Immagini di questa struttura di laboratorio versatile, logisticamente-enhanced è illustrato nella Figura 1.

Questo rapidamente dispiegabili, funzione del laboratorio ha un design espandibile simile alla clinica contenitore precedentemente descritti (‘Pod Smart emergenza’)12,13,14, sviluppato da Baylor College of Medicine e sponsorizzato da USAID. Una singola unità imballata (nella modalità di trasporto) ha le dimensioni di 9 piedi 9 pollici x 8 piedi x 8 piedi (Figura 1A, B) e si espande per una superficie di 170 mq (15,75 m2) (Figura 1, D). L’unità può essere distribuito da due a quattro persone in meno di dieci minuti.

Il laboratorio remoto è costruito per un impianto di laboratorio BSL-2 (Figura 2A) con un separato, modulare, associabile, BSL-3 unità (Figura 2B) progettato per il lavoro con agenti infettivi che possono causare malattie gravi o potenzialmente letali per inalazione 15. la connettività dei moduli due laboratorio consente l’ottimizzazione dei flussi di lavoro di sperimentazione, la condivisione delle risorse e risparmio (Figura 2C-E).

I moduli sono a tenuta di aria e acqua-stretto per creare un confortevole, energia efficiente riparo mobile. Riscaldamento, ventilazione e climatizzazione (HVAC) viene utilizzato per le unità centralizzata e temperatura controllata. In generale, il design delle unità laboratorio riduce al minimo il consumo energetico grazie all’utilizzo di proprie fonti di alimentazione alternativa come pannelli solari e/o un generatore elettrico indipendente. Ogni unità comprende un lavandino e stazione lavaggio oculare, energia elettrica e acqua connettori (Figura 3A-C). La piattaforma ICT offre un optional, tablet basato (telefono/Tablet Android o iPhone/iPad) documentazione app per alimentazione rilevamento e documentazione del risultato di laboratorio (Figura 3D) sviluppato in collaborazione con di Baylor Information Technology (IT) gruppo di ricerca che è ben sperimentato a lavorare in ambienti remoti con connettività limitata. Il sistema può funzionare anche con segnali cellulari o wireless e permette la documentazione senza connettività, con backup immediato o la trasmissione a un cloud sicura basata su server quando viene ristabilita la connettività.

Il laboratorio dispone di diverse funzionalità di infezione-controllo chiave, tra cui: (a) aria flusso, (b) un vano portaoggetti o biosicurezza armadietto, (c) una gestione del rischio salute sistema di pressione negativa: un germicida ultravioletta (UV-C) sistema di illuminazione utilizzando 4 gerarchie di difesa provata per eliminare il 99,7% di agenti patogeni che causano le infezioni correlate all’assistenza sanitaria. La struttura è facilmente disinfettata con perossido di idrogeno o ipoclorito di sodio (candeggina) sistemi per la decontaminazione efficace ed efficiente. 16

La garanzia della qualità dei risultati di laboratorio dipende da un impegno a valutare tutti gli aspetti del processo di test diagnostici di interezza. Qui, presentiamo un elenco di controllo per il flusso di lavoro di laboratorio BSL-2 e BSL-3 e un protocollo per test diagnostico rapido virus respiratorio. La diagnosi proposta delle malattie virali si basa sulla rilevazione del DNA o del RNA virale nel provino (lavaggio nasale, sangue, feci e urina, ecc.) mediante reazione a catena della polimerasi d’inversione-trascrizione in tempo reale (RT-PCR). La capacità di stimare rapidamente carichi virali in un esemplare di rende PCR uno strumento efficace per la malattia virale17,18di screening. L’implementazione del romanzo, saggi diagnostici molecolari consente di espandere le capacità diagnostiche per i virus come Ebola19,20,21, riossidazione8,22e la tubercolosi (TB )23.

L’obiettivo di questo lavoro è quello di convalidare un romanzo laboratorio modulare e rapidamente dispiegabili e fornire una guida di formazione per il personale di laboratorio che lavorano in ambienti remoti, risorse limitate durante un’epidemia, una catastrofe naturale o altri aiuti di emergenza situazione. Qui, presentiamo un protocollo per la diagnosi dell’influenza respiratoria in questo laboratorio innovativo, portatile.

Protocol

1. installazione Nota: Solo 2-4 persone sono necessari per distribuire l’unità “Lego-come” laboratorio. In modo ottimale, 4 individui sarebbero stati utilizzati per distribuire, ma è possibile con solo 2. Utilizzare un carrello elevatore a forcale (Figura 1A,B) o altro idoneo dispositivo di sollevamento per gestire il contenitore. Utilizzare un carrello elevatore a forcale con almeno sette tonnellate di capacità di sollevamento per gestire due tipi di contenitori24. Per impostare un’unità di laboratorio, è possibile selezionare una patch di circa 90 x 60 piedi quadrati (27,4 x 18,3 m2) su un paesaggio piatto per garantire che ostruzioni non ostacolano il layout corretto. Assicurarsi che il sito abbia ben drenati per assicurare il drenaggio del cantiere come ciò potrebbe causare potenziali problemi con dissipazione di acqua dopo la pioggia cadono. Utilizzare il giardino che sia stato precedentemente livellati e che sono duro terreno compattato di una resistenza alla compressione minima di 10 kN/dm2. La zona circostante dovrebbe consentire l’accesso al materiale necessario per lo scarico l’unità dal suo dispositivo di trasporto e le attrezzature di supporto necessarie per realizzare il compito di ospitare. Posizionare l’unità o le unità in modalità’ trasporto’ al centro del sito selezionato e regolare il livello. Ogni unità è dotata di quattro martinetti di livellamento per consentire la distribuzione su un sito che ha un grado massimo di 6,5% (~ 4 gradi). La quota minima per i contenitori è ~ 6 pollici per garantire che i tubi di scarico e scarichi a pavimento funzionano correttamente. Non si estendono prese più di 12 pollici. Fissare la staffa di supporto per il braccio della presa. Assicurarsi che il contenitore sia livello inserendo un livellatore bolla al centro di ogni binario inferiore. Espandere l’unità finché non è stato correttamente posizionato! Espandere l’unità aprendo i pannelli per la piena funzionalità. In primo luogo individuare il palo di supporto a due pezzi. Collegare il palo di supporto in modo che la sua altezza è alta quasi quanto l’unità di contenitore. Il Polo consente all’utente di aprire il pannello e sostenere il peso del Pannello tetto come si aprono le porte laterali. C’è una clip di sicurezza che agisce come un perno per mantenere i pannelli bloccati. Rimuovere la clip di sicurezza prima di tutto, quindi sollevare ed estrarre il perno di blocco camma dal foro. Posizionare il perno dietro la leva e fuori mano la leva di blocco camma situate sui lati (espandibile) inferiore del contenitore. Alzare il tetto pannello 1 considerando che questo pannello ha gas puntoni e una volta sbloccate le porte di pannello, rilascerà i puntoni. Questo permetterà all’utente di alzare il tetto (pannello 1) utilizzando il palo di supporto a due pezzi. Spostare la punta del palo di supporto sotto il pannello del tetto per sostenerlo temporaneamente (Figura 4A). Mentre che tiene il pannello del tetto con il supporto di poke, trovare la catena di sicurezza, che si trova in alto a sinistra sul lato del contenitore. Con l’assistenza di 2-3 persone, con cura di trascinare verso il basso pannello 2 fino a quando la catena di sicurezza è dritta, tenendo il peso del pannello 2 e si è impegnata. Collegare al passaggio della cintura verricello al Monte aletta a mano avvolgendolo intorno all’esterno del puntone gas. Nota che se non esiste alcuno strumento di verricello, passaggio precedente può essere completato manualmente con almeno due persone su ogni lato del pannello della holding e abbassarla manualmente.Attenzione: Il peso del pannello è di 260 lb! Garantire che non esistono persone o oggetti nel modo Panel 2 e utilizzo dell’argano e trapano, procedere per abbassare il pannello (Figura 4B). Pannello 2 è completamente abbassato, scollegare la cinghia del verricello e bobina indietro nell’argano. Rimuovere l’argano e posizionarlo sul lato opposto del contenitore in preparazione per l’uso. Entrambi i lati dell’unità sono identici e seguono la stessa procedura sopra per l’altro lato dell’unità. A completa distribuzione del primo lato, arrivano fino al pannello (che è attualmente al piano) e con almeno due persone su ogni lato, sollevare manualmente pannello 3 verso l’alto in posizione come la porta e la parete anteriore del lato (Figura 4). Le due persone rimarrà per tenere il pannello 3, mentre la terza persona rimuove il palo di supporto.Attenzione: nessuno dovrebbe essere all’interno o sotto il tetto fino alle 3 pannello di parete è a posto! Dall’interno del pannello 3, individuare i due fermi e bloccarli in posizione utilizzando la cinghia di sicurezza. Assicurarsi che le guarnizioni di gomma del Pannello tetto nero sono tirate fuori a faccia all’interno delle unità. Questo deve essere fatto per evitare che pioggia e altri penetrazione di acqua nell’unità. Dall’interno del contenitore, sbloccare pannello 4. Una volta sbloccato, spingere fuori pannello 4 (Figura 4) così che dondola come una porta aperta. Ganci di sicurezza serratura i due all’interno della parete. Sbloccare il pannello 5 e ripetere la stessa procedura per pannello 4. Fissare questo pannello con fermi di sicurezza interna stessa. Una volta che è stato bloccato all’interno di intera unità, serrare nuovamente l’arridatoio fino al pavimento e muri di fine sono sigillati. Una volta che entrambi i lati del contenitore vengono espansi in modo sicuro, le prese ed effettuare adeguamenti necessari spostamenti che possono essersi verificati. Verifica il riparo per essere a livello settimanale. Dopo climatiche estreme (pioggia o vento) ispezionare prese sui contenitori e regolare di conseguenza. Espandere il contenitore secondo se i moduli di laboratorio collegabili sono progettati per l’uso (Figura 5). Collegare l’unità alla fonte di alimentazione e rifornimento idrico. Un istruzioni dettagliate sull’installazione di un generatore diesel collegato alle unità attraverso un pannello degli interruttori si trovano nel manuale secondo24.Nota: L’unità di laboratorio a distanza ora viene distribuito. Il volume interno non comprimibile dell’unità permette di memorizzare minimo di quella necessaria per le prove diagnostiche particolari attrezzature e laboratorio. Installazione di sistema di pressurizzazione per BSL-3 modulo è descritto in dettaglio24 e richiede ulteriore controllo di qualità. 24 2. lista di controllo per la protezione personale e del flusso di lavoro di laboratorio di base Nota: Un errore in uno dei generali di sicurezza e fasi di requisito di test di laboratorio può invalidare i risultati del processo di test. Prima di preparare all’interno dell’unità di laboratorio installato, assicurarsi che tutti i requisiti di sicurezza BSL-2 o BSL-3 sono contabilizzati: medicazione con dispositivi di protezione personale adeguata (PPE), lavarsi le mani, i guanti e decontaminare le aree di lavoro sono per essere utilizzato. Seguire la checklist in tabella 1 che contiene i requisiti di sicurezza per la protezione personale durante i test eseguiti in laboratorio BSL-2 e il modulo di BSL-3 (assemblato glove box camera – pressione negativa e la camera PCR – pressione positiva). Decontaminare tutti lo spazio di lavoro e forniture in laboratorio. Se si prevede di utilizzare la soluzione di ipoclorito di sodio (0,5%), conosciuto anche come candeggina, per decontaminare l’area di lavoro e forniture, anche utilizzare etanolo al 70% per pulire tutte le zone esposte per candeggiare, come candeggina può mescolare con altri prodotti chimici nell’area di lavoro per creare fumi tossici. Smaltire tutti i prodotti di candeggina nel proprio contenitore rifiuti designato. Prima di iniziare a lavorare nell’unità di laboratorio, acquisire familiarità con la disposizione e il layout. Rigide regole si applicano per l’elaborazione di campioni in camera portaoggetti (GB). La camera di GB è pressione negativa! Per far funzionare una glove box, controllare le istruzioni del produttore. Fonti multiple forniscono tutorial dettagliati su portaoggetti operazione25.Nota: Lo scopo di questo test è per estrarre e purificare l’acido ribonucleico (RNA) o acido desossiribonucleico (DNA), se presenti, dagli esemplari. Il DNA/RNA estratto sarà testato da un Real-Time RT-PCR per rilevare la presenza o l’assenza di agenti patogeni virali mirati – riossidazione (INF). 3. sistema diagnostico del virus influenzale rapida mediante RT-PCR in una struttura di laboratorio BSL-2 Ricevere e registrare Applicare l’elenco di controllo per i dpi (Vedi sezione 2). INF è un agente di classe 2 che richiedono pratica BSL-2. PPE appropriati per BSL-2 pratica è necessaria. Inoltre, indossare occhiali di sicurezza e camici da laboratorio manica con risvolto per ridurre al minimo il potenziale esposizione cutanea. Secondo organizzazione mondiale della sanità (OMS) consigli26, utilizzare Dacron sterile o tamponi di rayon con aste di plastica per campionamento dalle vie respiratorie.Nota: Cotone o tamponi di alginato di calcio o tamponi con bastoni di legno possono contenere composti che inattivano alcuni virus e inibiscono PCR test26,27. Come esempio tamponi sono presi dai pazienti, li trasporto all’impianto di laboratorio dal campo o clinica. Campioni di trasferimento tramite la finestra di pass-through; Questa finestra non può essere aperto da entrambi i lati. Nella finestra di pass-through, spruzzare le provette contenenti i campioni con candeggina per 1 min seguita da etanolo al 70% e asciugare al fine di fornire un’adeguata decontaminazione prima di entrare l’unità di laboratorio. Dopo l’immersione, il tecnico di laboratorio all’interno dell’unità sarà aprire la finestra di pass-through e raccogliere i campioni dal contenitore candeggina per essere registrato. Di solito, il far passare il campione e la persona che l’estrazione del campione non sono lo stesso. Aprire la finestra di pass-through e raccogliere i campioni deve essere registrato. Pulire eventuali campioni che sono stati disinfettati in candeggina ed etanolo. Pulire l’interno della finestra di pass-through con candeggina seguita da soluzione di etanolo 70%. Registrare un esempio all’interno del sistema interattivo basato su tablet o un computer portatile. Identificare un campione con le seguenti informazioni:-Data collection-Data inizio-Sesso ed età paziente-Tipo campione (ad es.., tampone nasale)-Unique identifier-Altre informazioni pertinenti Utilizzare i codici a barre per le etichette dei tubi. Aggiungere codice a barre per ogni provetta e quattro tubi vuoti designati per aliquote. Spostare i campioni alla cappa di sfiato. Scansione di un codice a barre su ogni tubo e assicurarsi che le informazioni di identificazione del campione corretto viene visualizzato sullo schermo di sistema o computer portatile tablet basato. Se i codici a barre non sono disponibili, utilizzare un pennarello resistente all’alcool. Sempre di segnare la cuvetta stessa, mai il tappo come questo può ottenere commutato durante la manipolazione! Completare il processo di registrazione. Aliquota di campione Una volta provette sono stati etichettati, utilizzare un armadietto di biosicurezza classe 2 certificato per trattare i campioni e rendere le aliquote di campioni. Un’aliquota può essere utilizzata per il test immediato e gli altri conservati per scopo di riferimento o riprove. Come esemplari arrivano con punta del tampone nasale nel mezzo di trasporto virale, fomentare la punta del tampone nel mezzo per 30 s e spremere esso contro il lato del flaconcino. Quindi rimuoverlo dal medio e smaltirlo con un protocollo di rifiuti a rischio biologico (opportunamente scartare, autoclave o appendere in soluzione di cloro 1: 100).Nota: Il più piccolo volume del mezzo che deve essere archiviato è 0,5 mL. Così, un campione di 3 mL può essere diviso in sei aliquote (sottocampioni). Utilizzare tubo di cryo-deposito di 1 mL per ogni campione da 0,5 mL per fornire volume extra per mezzo congelato. Quando si scattano le aliquote, utilizzare freschi pipette sterili o monouso per ogni campione e gettarli nei contenitori dei rifiuti a rischio biologico al fine di evitare la contaminazione incrociata. Assicurarsi che ogni tubo è ermeticamente sigillato e chiuso. Utilizzare un’aliquota per campione per estrazione immediata e conservare qualsiasi altre aliquote in freezer (a-80 ° C come esso è un campione respiratorio) per un utilizzo futuro. Prima di trasferirsi alla stazione di lavoro, pulire tutte le superfici dell’area di lavoro e attrezzature con candeggina seguita da soluzione di etanolo al 70%. Estrazione e purificazione Per assicurare la qualità dei test, spostare il codice a barre di PCR esempio aliquote da trattamento zona fino alla stazione di lavoro (armadietto di sicurezza BSL-2) destinata per l’estrazione del campione. Questo armadietto di sicurezza dispone di un set separato di pipette per la manipolazione del campione. Utilizzare il kit mini di RNA virale per l’estrazione dei campioni del RNA. Seguire le istruzioni del produttore per la purificazione di RNA virale dal protocollo di spin. Preparare il mix master secondo il numero di campioni che devono essere estratti. Mantenere il campione e Lisi mix master tampone a temperatura ambiente. Preparare il numero di campioni che devono essere estratti. Etichetta la mL 1,5 micro-provette con i numeri di codice a barre o l’identificatore univoco. Impostare la pipetta a 560 µ l. applica una pipetta pulita. Aggiungere 560 µ l di tampone di lisi in ogni provetta etichettata. Eliminare la punta. Applicare una pipetta pulita. Aggiungere 140 µ l del campione. Eliminare vecchi e applicare una pipetta pulita. Ripetere con l’altro campione. Applicare una pipetta pulita. Aggiungere 140 µ l di tampone alla provetta di controllo negativo. Chiudere ogni tubo. Impulso-vortice del campione 1 aliquota con il tampone di lisi per 15 s. Repeat con aliquota di campione 2 e il tubo di controllo. Micro-centrifuga ogni campione per 5 s. Incubare i campioni per 10 min a temperatura ambiente. Dopo 10 min di incubazione, ri-Centrifugare le provette per rimuovere eventuali gocce all’interno di ogni coperchio del tubo. Aggiungere 560 µ l di soluzione di etanolo al campione. Cambiare il puntale della pipetta. Ripetere l’operazione con qualsiasi residuo o ulteriori campioni. Chiudere saldamente ogni provetta e impulso-vortice di esempio per 15 s. Micro-Centrifugare i campioni per 5 s. Applicare la miscela per la colonna di spin. Ottenere pulito 2 mL provette per il prelievo. Aggiungere colonne di spin e con l’etichetta per abbinare i campioni. Trasferire 630 µ l di campione corrispondente colonna, di conseguenza. Fissare tappi e spostare la centrifuga. Distribuire uniformemente i campioni nella centrifuga. Centrifugare a 6.000 × g per 1 min rimuovere il tampone di lisi. Tornare alla stazione di lavoro. Sostituire i tubi di raccolta. Aggiungere il restante buffer di lisi e ripetere il passo di centrifugazione. Scartare i tubi aliquota del campione originale. Smaltire l’eluato e lavare la colonna di spin con due buffer. Applicare 500 µ l di Buffer AW1. Ripetere l’operazione con ogni campione. Fissare i tappi di ogni campione e centrifugare a 6.000 × g per 1 minuto. Ripetere con il secondo Buffer AW2 e centrifugare a 20.000 × g per 3 min. Infine eluire il RNA aggiungendo tampone di eluizione. Posizionare la colonna in una provetta pulita 1,5 mL, aprire la colonna e aggiungere 60 µ l di tampone Ave. Incubare a temperatura ambiente per 1 min e centrifugare a 6.000 x g per 1 min. I campioni sono pronti per l’analisi di PCR. Rilevamento e l’amplificazione di PCR Eseguire l’amplificazione di PCR in una zona separata destinata per la PCR. Svolgere l’amplificazione di PCR del bersaglio virale usando il protocollo PCR per una procedura passo secondo le istruzioni del produttore. Si noti, è realizzato in un mix master virali specifici primers, sonde, 2 x RT-PCR buffer ed enzima RT-PCR. Aggiungere il mix master a piastre o tubi e quindi aggiungere e miscelare i campioni individuali (vedere paragrafo 4.4). Trasferire la piastra alla macchina PCR ed eseguire secondo le condizioni di amplificazione del bersaglio virale. Una volta che i campioni vengono caricati sullo strumento PCR ci vogliono circa 90 minuti per completare l’esecuzione. Manutenzione dopo l’utilizzo di attrezzature Eseguire la manutenzione regolare e periodica dopo l’utilizzo di apparecchiature secondo la tabella 2. 4. sistema diagnostico del virus influenzale rapida mediante RT-PCR in una struttura di laboratorio BSL-3 Nota: In condizioni di BSL-3, il protocollo sperimentale rimarrà lo stesso, ma le misure di sicurezza avrà la precedenza sopra ogni altra cosa. Prima di entrare il Laboratorio BSL-3, guardare attraverso la finestra trasparente per essere sicuri che la pressione negativa è stata stabilita nell’unità portaoggetti. Sarà evidente che la pressione negativa è stato stabilito quando una palla rosa in una parete è visibile. Ricevere e registrare Una volta stabilita la pressione negativa, aprire la porta ed entrare nell’unità. Lavare immediatamente le mani e poi procedere con il PPE. Applicare l’elenco di controllo per PPE e workflow BSL-3 (vedere sezione 2). Procedere a mettere il PPE nel seguente ordine: sotto abito, guanti, secondo paio di guanti, copriscarpe, maschera, maschera di protezione. Si consiglia di indossare un abito completo che protegge tutto il corpo. Accendere la macchina e lasciare pressione nel vano portaoggetti per stabilizzare. Utilizzare una soluzione di candeggina spray per disinfettare tutte le aree ed i Forniture per essere usato dentro e fuori il cassetto portaoggetti. Smaltire i residui di candeggina in un contenitore unico di candeggina. Soluzione di etanolo al 70% di uso per pulire eventuali aree di candeggina è stato utilizzato. Trasferire il campione tramite la finestra di pass-through.Nota: Prima di aver abbandonato al passo attraverso la finestra, disinfettare le provette contenenti i campioni immergendo in un bagno di ipoclorito per un minimo di 1-2 in particolare, spruzzare i campioni con una soluzione di candeggina e lasciare da solo per almeno 1 min e pass-through prima di riceverli all’interno dell’unità di BSL-3. La persona passando il campione dall’esterno e la persona che riceve, estrarre il campione all’interno del laboratorio BSL-3 non dovrebbe essere lo stesso. Ricevere i campioni all’interno dell’unità di BSL-3 e pulirli prima di procedere con la registrazione e procedura di etichettatura. Registrare un esempio con il sistema interattivo basato su tablet o un computer portatile. Identificare un campione con le seguenti informazioni (Vedi sezione 3.1.5). Utilizzare i codici a barre per le etichette dei tubi. Se i codici a barre non sono disponibili, utilizzare un pennarello resistente all’alcool.Nota: Contrassegnare sempre il flacone stesso, mai il tappo come questo può ottenere commutato durante la manipolazione! Aliquota di campione Una volta che i campioni sono registrati e tubi è stato etichettato, inserire i campioni certificati glove box tramite l’aria bloccata vassoio per recuperare i campioni da dentro il vano portaoggetti. Chiudere la porta. Quindi aprire l’altra porta attraverso il vano portaoggetti per recuperare i campioni. Non aprire entrambe le porte in una sola volta. Aprire e chiudere ogni porta in due diverse fasi per le precauzioni di sicurezza. Accendere la luce UV-C. Una volta che i campioni sono stati spostati in modo sicuro all’interno del vano portaoggetti, seguire i passaggi descritti in precedenza per la creazione di aliquote del campione in una scatola di guanto. Un’aliquota del campione può essere utilizzata per il test immediato e gli altri conservati per scopo di riferimento o riprove. Il campione arrivi con la punta del tampone nasale nel mezzo di trasporto virale. Prendere campioni e mettere uno in ogni flaconcino. Mescolare la punta del tampone nel mezzo per 30 s e spremere esso contro il lato del flaconcino prima di rimuoverlo dal mezzo e lo smaltimento, utilizzando un protocollo di rifiuti a rischio biologico (opportunamente scartare, autoclave o appendere in soluzione di cloro 1: 100).Nota: Il più piccolo volume del mezzo che deve essere archiviato è 0,5 mL, fiale 1 mL uso per questo scopo. Così, un campione di 3 mL può essere diviso in sei aliquote (sottocampioni). Utilizzare freschi pipette sterili o monouso per ogni campione e gettarli come rifiuti a rischio biologico. Una volta che i campioni sono aliquotati, spostare i campioni in contenitore ermetico. Chiudere i flaconi con protezione e rimuovere il vano portaoggetti. All’interno il vano portaoggetti, chiudere il sacchetto dei rifiuti a rischio biologico e preparare un nuovo sacchetto di rifiuti per evitare la contaminazione incrociata. Decontaminare l’area di lavoro di portaoggetti applicare candeggina per 5 min e soluzione di etanolo 70% in seguito. Utilizzare un’aliquota per campione per l’analisi immediata e altri conservare in congelatore a-80 ° C in quanto è un campione respiratorio. Dopo decontaminazione mantenere un’aliquota per il test, è possibile spostare tutti i campioni fuori glove box per deposito in congelatore a-80 ° C. Estrazione e purificazione Dopo la decontaminazione, spostare le aliquote del campione con codice a barre necessarie per l’analisi PCR dall’esemplare area gestione nuovamente dentro il vano portaoggetti. In glove box, è necessario eseguire tutti i passaggi di lisi per la procedura di estrazione. Utilizzare il kit mini di RNA virale per l’estrazione dei campioni di RNA secondo le istruzioni del produttore. Seguire le istruzioni dettagliate per la purificazione di RNA virale dal protocollo di spin nelle istruzioni del produttore. Preparare il numero di campioni che devono essere estratti. Etichetta il 1,5 mL provette da centrifuga micro con i numeri di codice a barre o l’identificatore univoco. Aggiungere 560 µ l di tampone di Lisi a 140 µ l del campione e impulso vortice. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Nota: La procedura di inattivazione può variare a seconda del tipo di agente patogeno BSL-3 che vengono estratti e in alcuni casi ulteriori inattivazione può essere necessario. Dopo la fase di Lisi, strettamente di sigillare i tappi su ogni campione e inserire il passaggio di aria pressurizzata bloccato (se la centrifuga è posizionata all’esterno il vano portaoggetti). Trasferire i campioni lisati in cappa di biosicurezza per il resto della procedura.Nota: La procedura per l’estrazione e purificazione di RNA può essere completata nel vano portaoggetti o in una scatola di guanto seguita da governo di bio-sicurezza a seconda dell’agente patogeno BSL-3 e protocolli richiesti. Assicurarsi che decontaminare l’area di lavoro e forniture in glove box nuovamente utilizzando candeggina e soluzione di etanolo 70% per pulire tutte le aree precedentemente esposti alla candeggina. Seguire i passaggi nella sezione 3.3.6 – 3.3.10 per il lavaggio e la purificazione del RNA. Dopo l’estrazione, è possibile trasferire i campioni alla finestra del pass-through per l’analisi di PCR. Dopo i campioni è stato rimosso e trasferito, decontaminare l’area di lavoro di laboratorio di fuori della scatola per guanti, secondo la sezione 2. Prima di rimuovere PPE attendere circolazione dell’aria nell’unità in modo sicuro ha raggiunto il corretto numero di cicli prima di iniziare a rimuovere il PPE di filtrazione. Immediatamente dopo la rimozione e lo smaltimento di tutti i dpi in PPE contenitore per rifiuti, procedere al lavaggio mani in laboratorio con acqua e sapone prima di chiudere l’unità, secondo la sezione 2. Rilevamento e l’amplificazione di PCRNota: L’amplificazione di PCR viene eseguita in una zona separata designato per la PCR e collegati con l’area del vano portaoggetti tramite finestra di pass-through. L’area di lavoro e forniture devono essere decontaminati prima di un test. Rimuovere i campioni di RNA estratti dalla finestra pass-through. Eseguire l’amplificazione di PCR del bersaglio virale utilizzando il protocollo di PCR One-Step. Preparare un mix master utilizzando primers specifici virale, sonde, 2 x RT-PCR buffer ed enzima RT-PCR. Utilizzare una provetta da 1,5 mL con il seguente componente per ogni dosaggio mirato: acqua, primer e sonde, 2 x buffer ed enzima RT-PCR. Vortex e centrifugare il mix master. Aliquotare il mix master in ciascuna delle provette striscia. Restituire il kit PCR per stoccaggio a temperatura consigliata una volta che è stato preparato il mix master. Aggiungere i campioni individuali in ciascuna delle provette striscia utilizzando una punta separata tra ciascuna provetta di striscia. Girare la piastra campione o tubi a 1.500 giri/min per 1 min. I campioni sono pronti per essere caricati sull’unità PCR in tempo reale. Trasferire la piastra con i campioni dello strumento PCR ed eseguire la macchina secondo le condizioni di amplificazione del bersaglio virale. Ci vogliono circa 90 minuti per completare una corsa. Prima di raccogliere i risultati e lasciando il laboratorio, rimuovere PPE e decontaminare adeguatamente ogni workstation e la preparazione per i prossimi test diagnostici, in base alla sezione 2. Manutenzione dopo l’utilizzo di attrezzature Eseguire la manutenzione regolare e periodica dopo l’utilizzo di apparecchiature secondo la tabella 2.Nota: I tempi nel complesso diagnostico sono di circa 4 ore. Tempo di estrazione e PCR impostare tempo può variare a seconda del numero di campioni e il test diagnostico può richiedere 4-5 ore o più, corrispondentemente.

Representative Results

L’obiettivo di questo studio è di dimostrare che le strutture di laboratorio mobile BSL-2 e BSL-3 proposte forniscono un ambiente adeguato permettendo virus respiratorio test diagnostici con risultati rappresentativi identici alle prove eseguite in alta qualità laboratori fissi. I servizi di laboratorio sono realizzati in conformità con i requisiti di prova indicati nelle raccomandazioni di salute e sicurezza (OHS). Appena la struttura di laboratorio a distanza è distribuito (Figura 4) e tutte le attrezzature e forniture sono installati (Figura 5), test di laboratorio possono essere eseguiti. Secondo laboratorio procedure operative standard, PPE (camici, scarpe antinfortunistiche, guanti, avanzato maschera, occhiali protettivi, ecc.) appropriato per BSL-2 pratica è richiesto. Per pratiche BSL-3, il modulo di laboratorio PCR di pressione negativa è dotato di un vano portaoggetti certificato. Le unità di laboratorio vengono aggiornate da windows esterno pass-through per proteggere il personale nella fase di ricezione del campione. Il processo di registrazione può essere semplificato con applicazione di compresse a base precedentemente sviluppata (Figura 3D). Altre applicazioni accettabile che girano su un computer portatile possono essere utilizzati come bene. Questo test diagnostico particolare virus respiratori possa essere eseguito nei moduli collegati laboratorio per separare le fasi della procedura diagnostica allo scopo di evitare la contaminazione o potenziale interferenza tra Reagenti biochimici, che possono influenzare la i risultati delle prove. Per massimizzare la qualità della diagnosi, la pratica del test diagnostico rapido utilizza (i) sia il base Laboratorio BSL-2 e la camera PCR di traverse collegata (sezione 3) o (ii) le camere GB e PCR collegate da finestra pass-through (sezione 4). Il diagramma del flusso di lavoro di laboratorio proposto è presentato in Figura 6 e sottolinea la protezione personale. Il diagramma riconosce l’importanza di ogni passaggio indicato per la protezione personale, soprattutto se minimamente è addestrato personale di laboratorio in aree remote. Il test diagnostico rapido dell’influenza avviene tramite la tecnica di RT-PCR. La procedura contiene quattro fasi principali. Si noti che le singole aree di lavoro vengono assegnati per ogni fase del protocollo. Il primo passo è quello di ottenere un campione e suddividere in diverse aliquote. Le aliquote possono essere contrassegnate con i codici a barre per migliorare l’efficacia del controllo dati e conservate in freezer per ulteriori indagini. Il secondo passo è quello di inattivare un campione in tampone di lisi centrifugazione e di riscaldamento. La prima e la seconda procedura deve avvenire in biosicurezza. Utilizzare set di singoli pipetta e attrezzature. Un test PCR è proposto per essere eseguiti nella sala PCR, se disponibile. Il terzo passo è la documentazione dei risultati. Fase quattro è la manutenzione dopo l’utilizzo di attrezzature e ricordo della protezione personale alla fine dell’esperimento. Se il campione è previsto per essere classificati come BSL-3 + (e.g.,Ebola, Zika, MERS, TB) la funzione del guanto box deve essere utilizzata. Nel laboratorio remoto, la camera di GB ha una propria finestra pass-through per ricevere campioni e un computer portatile o tablet per registrazione dei campioni. L’aliquota di campione e inattivazione di virus deve essere eseguite nel vano portaoggetti. Illuminazione UV-C è consigliato per evitare la contaminazione durante la procedura. Dopo l’inattivazione di un campione, ulteriori passaggi per protocollo sono simili alla base Laboratorio BSL-2 e test BSL-3 e segue Checklist parte III (tabella 1, Figura 6). Figura 1. Prototipo di impianto di laboratorio. (A, B) Modalità di trasporto; (C) modalità distribuite: all’esterno; (D) modalità distribuite: interni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 . Schemi. (A) il base Laboratorio BSL-2; (B) The BSL-3 modulo comprende il vano portaoggetti e laboratori di PCR, che hanno una comune finestra di pass-through per trasferimento protetta dell’esemplare; Strutture di laboratorio collegato (C) (A) e (B) con utilità condivise. (D,E) Fotografie delle unità collegate da lati opposti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Nella figura 3. (A) interni della struttura BSL-3 ha (1) una finestra pass-through, un lavandino e (2) una stazione di lavaggio oculare all’ingresso; (B) energia elettrica, i connettori (C) acqua; (D) il software basato su Tablet per risultato di rilevamento e laboratorio di alimentazione documentazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . Distribuzione dell’impianto laboratorio. Istruzioni per pannelli dispiegarsi su un lato dell’unità come illustrato (A-D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 5 . Schemi del laboratorio collegabile: (A) BSL-2 modulo 1; (B) portaoggetti e PCR modulo 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 6 . Diagramma di flusso per una prova di RT-PCR diagnostica virus respiratorio nella struttura laboratorio remoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Remoto laboratorio BSL-2 Remoto laboratorio BSL-3 Parte I Parte I i. lab tech per entrare attraverso la porta denominata ingresso e mettere il camice da laboratorio, che è appeso sulla cremagliera accanto alla porta d’ingresso. Scarpe aperte sono vietate, avanzata maschera e occhiali protettivi sono incoraggiati. i. tecnico di laboratorio a guardare nella finestra della scatola per guanti da all’esterno unità per assicurare la pressione negativa è attivato. (Palla rosa dovrebbe essere visibile nell’unità per mostrare che la pressione negativa sta lavorando). II. Lab tech per lavarsi le mani nel lavandino, indossare guanti monouso e iniziare con l’assunzione di campioni. II. se pressione negativa sta lavorando, tecnico di laboratorio per entrare attraverso l’unica porta e mettere il camice da laboratorio, che è appeso sulla cremagliera accanto alla porta d’ingresso.  Scarpe aperte sono vietate, avanzata maschera e occhiali protettivi sono desiderabili. III. i campioni che sono stati immersi nel bagno di ipoclorito prima di essere caduto alle finestra di pass-through sono seduti in pass-through per tecnico di laboratorio. III. Lab tech per lavarsi le mani nel lavandino, indossare guanti monouso, PPE e iniziare con l’assunzione di campioni. IV. ricevuto nel ricevimento campionario. IV. i campioni che sono stati precedentemente immersi nel bagno di ipoclorito prima di essere caduto al passo attraverso la finestra sono seduti in pass-through per tecnico di laboratorio. Parte II v. ha ricevuto nel ricevimento campionario. v. a seconda procedura diagnostica, esemplari si trasferì a cappa di biosicurezza e inattivato. Parte II vi. gli esemplari predisposto per microscopia, centrifuga o marcisce. vi. gli esemplari inattivati nel vano portaoggetti. VII. appropriati test diagnostici eseguire. VII. i campioni eseguiti per l’isolamento dell’acido nucleico. VIII. conservare i campioni in frigorifero a 4° C o in freezer appropriato. VIII. dopo l’estrazione, gli esemplari spostato in finestra pass-through. Parte III IX. Lab tech entra attraverso ingresso nel lato PCR dell’unità (pressione positiva). IX. utilizzare il lavandino per colorazione & lavaggio di piatti. x. tecnico di laboratorio per mettere il camice da laboratorio da rack accanto all’ingresso, lavarsi le mani nel lavandino, indossare dei guanti. x. utilizzare notebook e counterpace per eseguire analisi e documentazione. XI. ricevere i campioni dalla camera Glove Box nella finestra pass-through. XI. sterilizzare attrezzature eseguendo autoclave. XII. se necessari campioni predisposto a flusso laminare. XII. Smaltire tutti i rifiuti a rischio biologico nel contenitore per rifiuti biologici. eseguire test di diagnostica XIII. appropriato. XIII. lavarsi le mani nel lavandino. XIV. conservare i campioni in frigorifero a 4° C o in freezer appropriato. XIV. appendere il camice da laboratorio backup sulla cremagliera. Parte III XV. uscire attraverso la porta stessa. XV. usare il lavandino per colorazione & lavaggio di piatti. XVI. utilizzare notebook e counterpace per eseguire analisi e documentazione. XVII. trasferire fiale in pass-through finestra in camera PCR e sterilizzare attrezzature eseguendo autoclave. XVIII. Smaltire tutti i rifiuti a rischio biologico nel contenitore per rifiuti biologici. XIX. lavarsi le mani nel lavandino. XX. uscire attraverso la stessa porta d’ingresso. Tabella 1. Elenco di controllo per il flusso di lavoro PCR diagnostica. Manutenzione e tarature Sistemi Real-Time PCR Mensile Realizzi le calibrature sfondo ogni mese 18 mesi Eseguire in background, spaziale e tingere tarature ogni 18 mesi dith Centrifuga 1 anno Calibrare per giri al minuto e la temperatura attraverso servizi di taratura esterna o interna Scatola per guanti Giornaliero Ispezionare visivamente gli elementi, in particolare per danni per le superfici esposte dei filtri HEPA, guanti, guarnizioni e tubi flessibili. Assicurarsi di dotto morsetti sono stretti e a posto. Eseguire test di pressione di perdita. L’allarme di pressione di prova. 6 mesi Cambiare il filtro HEPA 1 anno Calibrazione del sistema Autoclave Download Pulire il serbatoio dell’acqua e rack utilizzando un detergente non abrasivo 3 mesi Calibrare il timer e calibri 1 anno o ogni 50 cicli Ispezionare, pulire accuratamente, testare e calibrare Frigorifero e Freeezer 6 mesi Controllare motore, evaporatore ventilconvettori, l’aspirazione di condensor filtri e batterie condensanti e sostituire le batterie quando necessario 1 anno Calibrare il congelatore attraverso servizi di calibrazione interna o esterna Tabella 2. Manutenzione di apparecchiatura di PCR in tempo reale. Obbligatorio Consigliato Camice da laboratorio, scarpe antinfortunistiche, guanti Camice da laboratorio, scarpe antinfortunistiche, guanti, maschere, occhiali Frigorifero 4 ° C, congelatore a-20 ° C 4 ° C,-20 ° C, congelatore-frigorifero-congelatore-80 ° C Un set di pipette automatiche Tre set di pipette automatiche Centrifuga, shaker, termociclatore Sistema robotico Macchina di RT-PCR, bagno di ghiaccio RT-PCR con controllo della temperatura, dispositivo di raffreddamento libero dai ghiacci Sacchetti dei rifiuti rischio biologico Autoclave per smaltire i rifiuti a rischio biologico Tabella 3. Requisiti minimi per il virus respiratorio di RT-PCR diagnostico test BSL-2.

Discussion

La struttura di laboratorio remoto descritta sopra è logisticamente-oriented, espandibile, rapidamente dispiegabile, multifunzionale e basato su concetti di design antropocentrico che sono stati orientati per proteggere l’efficienza del personale e dell’area di lavoro di laboratorio. Il protocollo dettagliato per laboratorio rapido set-up e isolamento sicuro virus respiratorio e diagnosi è stato sviluppato e presentato.

Per attrezzatura ottimale funzionamento, le seguenti condizioni devono essere mantenute nelle unità di laboratorio: temperatura ambiente di 21 ± 2 ° C, temperatura ammissibile di 5 a 40 ° C, umidità 14 ± 5% RH umidità relativa massima dell’80% RH (senza condensa), e un’altitudine compresa tra 0 e 2.000 m sul livello del mare.

Consumo di energia è uno dei parametri più importanti per la gestione di un laboratorio di fuori-griglia. Per attrezzature di laboratorio di anima, l’efficienza energetica può differire 15-40%; Tuttavia, il consumo medio di energia è stimato qui per fornire un adeguato servizio. Il più alto tasso di potenza (1.500-2.000 W) riguarda il condizionatore d’aria, il sistema cassetto portaoggetti, la macchina PCR e la sterilizzatrice autoclave. Considerando 8 ore di intenso lavoro svolgendo il protocollo e 16 ore di controllo ambiente di laboratorio, il consumo di energia giornaliero delle unità del laboratorio è di circa 36 kWh/giorno per BSL-2, circa 43 kWh/giorno per BSL-3 e 73 kWh/giorno per il collegato BSL-2/BSL-3 + servizi. Per una singola unità, si consiglia di fornire una fonte di energia elettrica con capacità di esecuzione/continua potenza ≥ 8 kW, a partire dell’impulso/potenza ≥ 10 kW; per l’impianto collegato, esecuzione/continua potenza ≥ 12 kW e contro le sovratensioni/avviamento ≥ 14 kW di potenza. Si noti che, nella struttura Laboratorio BSL-3, una fonte di energia di backup si raccomanda vivamente di evitare l’interruzione di alimentazione accidentale e garantire il lavoro costante del sistema di pressione negativa e portaoggetti durante un test diagnostico.

Un generatore elettrico benzina è una soluzione economica per la fornitura di energia d’emergenza. Si supponga che l’efficienza del carburante di un generatore a benzina è di circa 1,5 galloni per ora a carico del 100%. Quindi, se il consumo di energia giornaliero medio è 8 ore del 40% del carico e 16 ore di carico del 10%, l’unità di laboratorio BSL-2 o BSL-3 richiede 7-9 galloni di carburante al giorno, corrispondentemente, e l’impianto collegato ha bisogno di ~ 15 gal/giorno.

Le unità di laboratorio a distanza sono progettate per adattarsi a funzionalità del pannello solare di fuori-griglia sistemi. Pannelli solari non richiedono combustibile aggiuntivo e può essere azionati con elevata produttività nelle regioni tropicali e subtropicali di Africa, Asia e America Latina a causa l’alta irradiazione solare. Attualmente, una unità di un sistema disponibile in commercio pannello solare permette un consumo energetico quotidiano di fino a 44 kWh/giorno.

Indipendentemente dal tipo selezionato di fonte alternativa di energia elettrica, elettricità sporca filtri sono fortemente raccomandati e preinstallati in strutture di laboratorio per migliorare la qualità dell’alimentazione e per proteggere le apparecchiature di laboratorio. Mantenere il sistema PCR lontano da fonti di radiazioni elettromagnetiche non schermati e forte perché forti radiazioni elettromagnetiche possono interferire con il corretto funzionamento del dispositivo. È anche importante non utilizzare il sistema PCR vicino a forti vibrazioni fonti, ad esempio una centrifuga o pompa, perché eccessive vibrazioni influenzerà le prestazioni dello strumento. L’apparecchiatura del laboratorio può essere installato solo in un ambiente con sostanze inquinanti non conduttivi, come particelle di polvere o trucioli di legno. Lasciare la camera lontano da eventuali aperture che potrebbero espellere materiale particolato sui componenti dello strumento.

L’utilizzo di acqua di laboratorio dipende dal numero di test diagnostici in esecuzione ogni giorno e numero di tecnici di laboratorio che lavorano nella struttura. Acqua gratuita nucleasi è necessaria per la preparazione di miscelatori durante la procedura diagnostica di estrazione e test PCR e dovrà essere consegnata in anticipo come altri materiali di consumo e prodotti chimici. Almeno 50 mL di acqua libera nucleasi è necessario per eseguire un test diagnostico; il volume richiesto di acqua gratuita nucleasi dipende dal carico di lavoro (cioè, il numero di campioni). Acqua distillata è necessario per eseguire la sterilizzatrice autoclave. Consumo acqua autoclave in un ciclo è di 160-180 mL; l’autoclave è consigliato per uso quotidiano. La maggior parte delle materie plastiche (tubi, puntali per pipette, ecc.) sono USA e getta, ma alcuni sono riutilizzabili e hanno bisogno di essere lavati (grandi contenitori, rack, ecc.). Normale acqua corrente viene utilizzato per lavare le mani tra le procedure e il suo volume minimo è stimata in 15-20 L al giorno. L’acqua deve essere pompata per pressione; sistema di pre-filtro sedimenti è consigliato per proteggere le apparecchiature di acqua dall’effetto dannoso dei sedimenti e per migliorare la qualità dell’acqua che scorre.

Per celle frigorifere, almeno un 5,1 piedi cubi frigorifero (+ 4 ° C) e un congelatore di 4,9 piedi cubi (-20 ° C a-30 ° C) sono necessari in ogni unità di laboratorio per conservare i campioni / RNA.

Decontaminazione di laboratorio comprende diversi livelli: pulizia > antisepsi > Disinfezione > sterilizzazione. Semplice pulizia può essere eseguita utilizzando acqua e sapone, mentre con una mano guantata o spazzola di sfregatura. Antisepsi includono lavaggio con liquido antimicrobico chimica al fine di inibire la crescita e la moltiplicazione dei germi. Soluzioni di alcool (70%) può essere utilizzato come un liquido antisettico. La disinfezione è l’applicazione di una sostanza chimica liquida per eliminare quasi tutti i microrganismi patogeni (ad eccezione di spore batteriche) su superfici di lavoro e attrezzature. Tempo di esposizione a sostanze chimiche, temperatura e concentrazione di disinfettante sono importanti. Soluzione di ipoclorito di sodio (0,5%), o candeggina, è un disinfettante efficace su larga scala per superficie purificazione e depurazione acque. Irradiazione ultravioletta germicida è un altro metodo di disinfezione. Una lampada germicida produce luce UV-C e conduce all’inattivazione di batteri e virus. Sterilizzazione si avvale di una procedura fisica o chimica di distruggere la vita microbica – tra cui spore batteriche altamente resistente. La sterilizzazione può essere eseguita con una sterilizzatrice autoclave.

Tutti i rifiuti di laboratorio devono essere separati al punto di generazione. Rifiuti solidi, non-tagliente, infettivi di posto in sacchetti ermetici contrassegnato come biohazard. Se rifiuti generati sono taglienti, esso deve trovarsi in contenitori a prova di puntura. Raccogliere rifiuti potenzialmente infettivi liquidi in contenitori correttamente etichettati biohazard per liquidi. Borse e contenitori non devono essere riempiti più di 2/3 del volume. Lo smaltimento di tutti i prodotti di candeggina dovrà essere ordinato nel proprio contenitore rifiuti designato. Rifiuti di laboratorio devono essere gestiti con delicatezza per evitare di generare aerosol e rottura dei sacchetti/contenitori. Borse/contenitori per la raccolta rifiuti a rischio biologico deve essere sigillate ed esterne superfici decontaminate dopo l’uso con soluzione di ipoclorito di sodio 0,5%. Tutti i rifiuti di laboratorio di sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 minuti prima dell’incenerimento. Fare riferimento al manuale di funzionamento per l’uso corretto di un’autoclave. Se possibile, aggiungere un indicatore chimico o biologico all’autoclave per assicurare la corretta sterilizzazione. Tutti i rifiuti solidi e liquidi in autoclave devono essere chiaramente etichettati come sterilizzati con l’impostazione, data, ora e operatore. I rifiuti con etichettato devono quindi trovarsi in una zona di sicura e separata prima dell’incenerimento.

Come previsto, flusso di lavoro di test diagnostico dipende dalla malattia ed esemplare. Se è consigliabile per l’identificazione di virus raccogliere campioni di sangue (ad esempio, Ebola19), si possono depositare le aliquote del campione a-20 ° C invece di-80 ° C (necessario per i virus respiratori). È sempre meglio prendere più di un esemplare durante il campionamento da un paziente rispetto al suddividere gli esemplari più tardi. Se possibile, per ogni tipo di campione almeno due esemplari devono adottare in provette separate. I campioni devono essere suddivisi se ulteriore campionamento non è possibile.

Se campioni alternativi non possono essere conservati a temperature appropriate (ad esempio, nessun congelatori sono disponibile), i tamponi devono essere conservati in puro (100%) etanolo o 99% alcool metilico (solo per gli additivi di metanolo). In questo caso, la punta del tampone deve essere messo in un flacone con 1-2 mL di etanolo. Notare che tali esemplari sono adatti solo per la PCR. Inoltre, nota che un’analisi consolidata è necessaria per ogni particolare virus diagnosi8,23, e campioni di virus sconosciuti devono essere inviati a laboratori assegnati per ulteriori indagini19,20, 21.

Requisiti obbligatori e consigliati per l’elenco delle attrezzature di laboratorio per le prove diagnostiche di PCR virus respiratorio devono essere riconosciuti. Tabella 3 sottolinea base e minimamente avanzate attrezzature (scelta consigliata) e requisiti per il test diagnostico di RT-PCR. Per pratiche BSL-3, protezione di pressione extra negativo (ad es., glove box) del personale è cruciale e necessario.

I moduli di laboratorio collegate sono preferibili per aumentare il numero del personale coinvolto nella prova di laboratorio e di accelerare il tempo richiesto per un singolo test. Sostituendo l’estrazione di RNA manuale che richiede tempo è possibile con qPCR automatizzati (ad es., QiaCube). Mentre questo strumento è ingombrante (larghezza 65 cm, larghezza 62 cm, altezza 86 cm), può andare bene l’area di lavoro di laboratorio mobile dopo il riarrangiamento di mobili in BSL-2 o BSL-3 unità.

Lavoro futuro sarà focalizzata sullo sviluppo di realtà aumentata (AR) e corsi di formazione di realtà virtuale (VR). Gli occhiali di AR/VR serviranno per fornire una piattaforma interattiva per insegnare competenze necessarie necessarie per diventare un lavoratore di laboratorio ben addestrato. Consigli utili per eseguire alcune delle procedure difficili, multistep in esami diagnostici di laboratorio verranno incluso nella guida del software. Questo approccio alla formazione del personale dovrebbe migliorare la qualità delle prestazioni del test diagnostico e gestione in remoto, soprattutto remoto e laboratorio aree risorsa vincolata.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il contenuto di questo articolo non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del noi dipartimento di salute e servizi umani o delle istituzioni affiliate con gli autori. Questa ricerca è stata sostenuta da Paul G. Allen Family Foundation “Zero-impatto, Smart Pod emergenza Enhanced”. Apprezziamo profondamente tutte le discussioni fruttuose e collaborazione con i colleghi di Baylor College of Medicine, salute GSS, Johnson Space Center della NASA. Siamo sinceramente grati a Thermo Fisher Scientifics e i suoi rappresentanti per un prestito della macchina RT-PCR, centrifuga e pipette automatiche per effettuare un test diagnostico di virus respiratorio all’interno della struttura di laboratorio a distanza. Gli autori sono grati a Marta Storl-Desmond e Sidney Stephen Sorrell per la loro assistenza nella preparazione del manoscritto e videografia.

Materials

Autoclave Sterilizer 'BioClave' Benchmark Scientific, Edison, NJ, USA B4000-16 16 liter, Benchtop, Dims: 22×17.5×15.7 in, Fully automatic, Extremely Compact
Barcode Scanner Zebra Technologies ZIH Corp., Lincolnshire, IL, USA Symbol LS2208 Handheld, lightweight
Breaker Box Panelboard Enclosure Square D (Schneider Electric), France  MH62WP  NEMA 3R/5/12, Dims: 20 W x 62 H x 6-1/2 in. D, Electrical distribution board
Centrifuge – Microcentrifuge 17,000 x g Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75002440 Holds 24 x1.5 or 2 ml tubes, Dims: 8.9×9.6×13.8 in
Class II Biological Safety Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-602-400 4 Ft. Class II Type A2 Cage Changing Biological Safety Cabinet, 12" Access Opening, HEPEX Pressure Duct 
Class III Biological Safety Cabinet (Glove box) Germfree Laboratories, Ormond Beach, FL, USA Model #PGB-36, Serial #C-2937 Glove box, Portable, 36", Class III BSC. Dims: 36x20x23.75 in, Includes 2 interior outlets
Cryo Coolers VWR, Radnor, PA, USA 414004-286 0.5 or 1.5 ml tube benchtop coolers
Freezer (30°C freezer) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA Model ULT430A To occupy 4.9 Cubic feet
Laminar Flow Cabinet NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA NU-126-300 3 Ft. Vertical Laminar Airflow Cabinet, 8" Access Opening, HEPA filter supply, 99.99%
Mini Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 75004061 Dims: 4.1×5.0x6.0 in
Pipettes automated VWR, Radnor, PA, USA 05-403-151 Pipet 4-pack (2.5,10, 100 and 1,000μL volume)
Pipettes automated 'Finnpipette' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4700880 Pipet 4-pack (2, 20, 200 and 1,000μL volume), Advanced Volume Gearing(AVG), Ultra durable
Power Generator Cummins Power Generation, Minneapolis, MN, USA C60 D6 60 kW, 60 Hz, 1 Phase, 120/240V, Diesel
Refrigerator BioMedical Solutions, Inc., Stafford, TX, USA BSI-HC-UCFS-0504W Standard Undercounter Refrigerators & Freezers
Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 05LRAETSA  To occupy  5.1 Cubic feet
RT-PCR machine 'Step-one plus' Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4376598 Holds 96 samples, Dims: 9.7×16.8×20.2 in 
Vortex Mix Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 88880017TS Dims: 6.1×8.3×3.3 in
Chemicals
AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 4387391
Ethanol Koptec Pure 200 Proof Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA V1001
Nuclease-free Water Ambion, Inc., Carlsbad, CA, USA AM9906
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 52906
SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 11732-088
Disposable
1 mL cryogenic tubes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 03-337-7X 
1.5 mL tubes VWR, Radnor, PA, USA 10025-726
10 µL Filter Tips Neptune, VWR, Radnor, PA, USA Neptune, BT10XLS3
20 µL Filter Tips Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, USA MultiMax, P-3243-30X
200 µL Filter Tips ART, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA ART, 2770
1000 µL Filter Tips Phenix Research Products, Candler, NC, USA TS-059BR
AB custom probes Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA N/A Custom probes
Combitips Eppendorf, Hauppauge, NY, USA 89232-972
Integrated DNA Technology (IDT) custom probes and primer IDT N/A Custom probes
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 490003-978 CS
MicroAmp Fast Reaction Tubes (8 tubes/strip) Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strip Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4323032
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA 4311971
Supplies
Biohazard waste bags VWR, Radnor, PA, USA 14220-046 20.3 x 30.5 cm Biohazard bags
Gloves Denville Scientific, Holliston, MA, USA G4162-250 Small, meduim or large Nitrile or latex gloves
Lab coat N/A N/A Customizable
Masks VWR, Radnor, PA, USA 414004-663 Advanced protection mask
Protective shoes N/A N/A Customizable
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Referencias

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Petrova, E. V., Avadhanula, V., Michel, S., Gincoo, K. E., Piedra, P. A., Anandasabapathy, S. Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics. J. Vis. Exp. (146), e59188, doi:10.3791/59188 (2019).
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