تثبيط النمو رشاشيه الخنزير و "إنتاج الأفلاتوكسين" في "الإعراب عن الذرة المعدلة وراثيا" المانع α-الأميليز من purpureus لابلاب ل.
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتحليل نمو رشاشيه الخنزير وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات الذرة معربا عن البروتينات المضادة للفطور. استخدام سلالة الإعراب عن التجارة والنقل (أ) الخنزير نحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. المقايسة سريعة وموثوق بها، واستنساخه.
Abstract
تلوث الأفلاتوكسين في المحاصيل الغذائية والعلفية يمثل تحديا كبيرا في جميع أنحاء العالم. الأفلاتوكسين، التي تنتجها الفطريات الخنزير رشاشيه (الخنزير (أ)) من المواد المسرطنة القوية التي تقلل إلى حد كبير قيمة محصول الذرة والمحاصيل الغنية النفط الأخرى مثل الفول السوداني إلى جانب مما يشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان. نهج مختلفة، بما في ذلك التربية التقليدية، والتعبير المعدلة وراثيا المقاومة المرتبطة البروتينات، والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])-على أساس إسكات الجينات التي يسببها المضيف الحرج الخنزير (أ) يجري تقييم أهداف الجينات، زيادة المقاومة الأفلاتوكسين في المحاصيل عرضه. وقد أظهرت الدراسات السابقة دوراً هاما من α-الأميليز في إنتاج المرضية والافلاتوكسين الخنزير (أ) ، مما يشير إلى هذا الجين/الإنزيم هدف محتمل للحد من نمو الخنزير (أ) وإنتاج الأفلاتوكسين. وفي هذا الصدد، وأجريت الدراسة الحالية تقييم تعبير مغايرة (تحت سيطرة المروج 35S كامب التأسيسي) بروتين مثبط مثل α-الأميليز purpureus لابلاب L. (أيلب) في الذرة ضد الخنزير (أ). أيلب هو بروتين 36-كاتشين، الذي هو مثبط تنافسي لأنزيم الأميليز α الخنزير (أ) ، وينتمي إلى أسرة بروتين مثبط يكتين – أرسلان – α-الأميليز المشتركة فول. وقد أثبتت الدراسات في المختبر قبل العمل الحالي دور أيلب في تثبيط النشاط α-الأميليز الخنزير (أ) ونمو الفطريات. وتم رصد نمو الفطريات وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي باستخدام سلالة الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء الخنزير (أ) . بسيط جداً لإعداد نواة هذا الفحص المقايسة (المملكة العربية السعودية) ويوفر بيانات موثوقة واستنساخه في الإصابة ومدى انتشار التي يمكن قياسها كمياً لتقييم الأصول الوراثية وخطوط محوره وراثيا. الأسفار من إجهاد بروتينات فلورية خضراء النمو ارتباطاً وثيقا للفطريات، واستطراداً، أنها مرتبطة جيدا لقيم الأفلاتوكسين. وكان هدف العمل الحالي لتطبيق هذه المعرفة السابقة في محصول تجارياً هاما مثل الذرة لزيادة مقاومة الأفلاتوكسين. نتائجنا تشير إلى انخفاض 35%-72% في نمو الخنزير (أ) في حبات الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب التي، بدورها، ترجمت إلى 62%-88% انخفاضا في مستويات الأفلاتوكسين.
Introduction
تلوث ميكوتوكسين من أجناس الفطريات، رشاشيه، تحززو Penicilliumو م هو مشكلة رئيسية للغذاء وتغذية المحاصيل المزروعة في جميع أنحاء العالم1،،من23. من بين هذه الفطريات فيتوباثوجينيك، قد رشاشيه أعلى الأثر السلبي على قيمة المحاصيل وصحة الإنسان والحيوان. رشاشيه الخنزير (الخنزير (أ)) هو ممرض مصنع انتهازية التي تصيب المحاصيل الزيتية غنية مثل الذرة والزيت والفول السوداني وينتج المواد المسرطنة القوية، الأفلاتوكسين، فضلا عن العديد من الأيض الثانوية السامة (SMs). الذرة غذاء هاما وتغذية المحاصيل التي تزرع في جميع أنحاء العالم وهو عرضه للتلوث الخنزير (أ). تفقد الآثار الاقتصادية للتلوث الأفلاتوكسين في وانخفاض قيمة في الذرة يمكن أن يكون قدر مبلغ 686.6 مليون في السنة في الولايات المتحدة2 مع التغيرات المتوقعة في المناخ العالمي، وتأثير الأفلاتوكسين يمكن أن يسفر عن خسائر اقتصادية أكبر في الذرة مع تقديرات مرتفعة في المستقبل القريب2دولار 1.68 بیلیون عام. ونظرا للآثار الاقتصادية والصحية الضارة من الأفلاتوكسين في البشر والماشية، مراقبة الأفلاتوكسين قبل الحصاد في الذرة قد تكون الطريقة الأكثر فعالية لمنع تلوث الأفلاتوكسين في الأغذية والأعلاف المنتجات.
نهج المراقبة قبل الحصاد الكبرى للمقاومة الأفلاتوكسين في الذرة التي تم استخدامها على نطاق واسع في العقود القليلة الماضية أساسا من خلال تربية، الأمر الذي يتطلب قدرا كبيرا من الوقت4. في الآونة الأخيرة، لذالك قد حققت بعض النجاح في الحد من الأفلاتوكسين في نطاق واسع مجال التطبيقات5،6. وإلى جانب لذالك، تطبيق الأدوات الجزيئية المتطورة مثل ‘”المضيفة التي يسببها الجينات إسكات”‘ (هيجس) من خلال [رني] والتعبير المحورة وراثيا من البروتينات المرتبطة بالمقاومة قد حققت بعض النجاح في الحد من نمو الخنزير (أ) والافلاتوكسين الإنتاج في الدراسات المختبرية والميدانية الصغيرة الحجم. ويجري حاليا الأمثل هذه النهج بالإضافة إلى تحديد جديد الخنزير ألف مورثة أهدافا محتملة للتلاعب مستقبلا.
بالإضافة إلى الجينات التي تشارك مباشرة في إنتاج ميكوتوكسين كأهداف محتملة من استراتيجيات مكافحة المحورة وراثيا، أظهرت amylases الفطرية تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على النجاح في إنتاج المرضية وميكوتوكسين خلال المراحل المبكرة الإصابة بالنبات المضيف. عدد قليل من الأمثلة على بيثيوم بليروتيكوم (عامل السببية تعفن رهيزومي الزنجبيل)، سولاني الفوزاريوم (وكيل المسببة الذبول قرنبيط)، حيث لوحظ الارتباط الإيجابي بين الإمراضية و α-الأميليز التعبير والنشاط 7،8. تثبيط النشاط α-الأميليز أما عن طريق خروج المغلوب الجينات أو النهج ضربة قاضية يؤثر تأثيراً سلبيا على إنتاج النمو والسمية الفطرية. وكان المسخ خروج المغلوب α-الأميليز من الخنزير (أ) غير قادر على إنتاج الأفلاتوكسين عندما تزرع في النشا الركيزة أو ديجيرميد حبات الذرة9. وبالمثل، في فيرتيسيليويديس مغزلاويه فشل عبئا خروج المغلوب α-الأميليز لإنتاج الفيومونيزين ب1 (ميكوتوكسين) خلال العدوى من حبات الذرة10. في دراسة حديثة، أظهر جيلبير et al. (2018) أن تدق على أساس [رني] أسفل الخنزير ألف- α-الأميليز التعبير من خلال هيجس انخفاضا ملحوظا الخنزير (أ) النمو والافلاتوكسين الإنتاج خلال العدوى نواة الذرة11 .
مثبطات محددة من النشاط α-الأميليز قد أسفرت أيضا عن نتائج مماثلة كما تم الحصول عليها من أسفل-تنظيم التعبير α-الأميليز. وجاء التقرير الأول بشأن دور المانع α-الأميليز في مقاومة الفطريات من عزل وتوصيف مثبط التربسين-α-الأميليز كاتشين 14 من خطوط الذرة مقاومة الخنزير (أ)12. كذلك فحص عدة مئات من الأنواع النباتية فاخوري ووولوشوك أدت إلى تحديد بروتين مثبط مثل α-الأميليز كاتشين 36 (أيلب) من بذور الفول صفير، لابلاب purpureus ل13. وأفادت تسلسل الببتيد ليكتينس أيلب تشبه لعائلة المانع يكتين – أرسلان – α-الأميليز المشتركة فول14،15. أيلب المنقي لا يحمل أي نشاط المثبطة نحو التربسين الثدييات وكذلك توصيف في المختبر أظهرت تثبيط كبيرة الخنزير (أ) النمو والإنبات كونديل13. التقارير المقدمة هنا وضوح يظهر α-الأميليز يمكن أن تخدم كهدف في نهج الرقابة للحد من مسببات الأمراض أو الآفات التي تعتمد على تعبئة النشا (من خلال نشاط α-الأميليز) واقتناء السكريات القابلة للذوبان كمصدر للطاقة خلال هذه الممرضة التفاعل مع النباتات المضيفة.
الأميليز ألفا ومن المعروف أن تكون حاسمة في الخنزير (أ) القدرة الإمراضية9،10،11، ونظرا لأهمية أيلب بوصفها ‘ مكافحة قوية-الخنزير ألف عامل (α-الأميليز تثبيط/لﻹنصاف)13، نحن تولد النباتات الذرة المعدلة وراثيا التي تعرب عن لابلاب أيلب الجينات تحت المروج كامب 35S التأسيسي. وكان الهدف التحقيق إذا كان تعبير مغايرة لهذا المانع α-الأميليز في الذرة فعالة ضد الخنزير (أ) إنتاج المرضية والافلاتوكسين أثناء الإصابة بنواة الذرة. نتائجنا تثبت أن حبات الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب إلى حد كبير انخفاض إنتاج الخنزير (أ) النمو والافلاتوكسين أثناء الإصابة بالنواة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العائد الخسائر في المحاصيل الزراعية بسبب مسببات الأمراض والآفات هو مشكلة عالمية20. حاليا، هو تطبيق لمبيدات الآفات ومبيدات الفطريات الاصطناعية الوسيلة الغالبة للسيطرة من مسببات الأمراض النباتية والآفات، ولكن سمية المتبقية من هذه بيوشميكلس في الأغذية والأعلاف يمكن أن تشكل ت?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ديفيد مينتس، جامعة أركنسو لمساعدته في وضع وتحليل الذرة المعدلة وراثيا خلال الأجيال المبكرة. هذا العمل وتلقى دعم مالي من وزارة الزراعة-أرس “المراكز الجهوية للاستثمار” المشروع 6054-42000-025-00D. الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل “وزارة الزراعة الأمريكية”. سياسة وزارة الزراعة أرس الفرصة (تكافؤ) ولايات تكافؤ الفرص لجميع الأشخاص ويحظر التمييز في جميع جوانب سياسات شؤون الموظفين التابعة للوكالة، والممارسات والعمليات.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
Referencias
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
