JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59164
, , ,
1Department of Enteric Infections, Bacterial Diseases Branch,Walter Reed Army Institute of Research, 2University of Alabama at Birmingham

Summary

Burada antikor serum Shigellacidal etkinliğini ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Serum bakteri ve inkübe, eksojen tamamlayıcı ile karıştırılır ve reaksiyon karışımı Ağar kaplamalar üzerinde kaplama. Canlı bakteri bir otomatik koloni Numaralandırıcı kullanarak ve bakterisidal titresi belirlemek için kullanılan dikkate alınır koloniler oluştururlar.

Abstract

Serum bakterisidal deneyleri (SBAs) antikorlar fonksiyonel etkinliğini ölçmek ve onlarca yıl için kullanılmıştır. SBAs doğrudan antikorlar Serumda bakteri için bağlamak ve tamamlayıcı etkinleştirmek için yeteneği değerlendirmek tarafından antikor öldürme etkinliği ölçmek. Bu tamamlayıcı aktivasyon lizis ve hedef bakterilerin öldürülmesi ile sonuçlanır. Çünkü onlar bu antikorlar var, araştırmacılar antikorlar enfeksiyon önlemede oynayabilir rolü çalışmaya izin biyolojik fonksiyonları aydınlatmak için antikor üretim miktarının ötesine gitmek bu deneyleri değerlidir. SBAs bağışıklık yanıtı pek çok insan patojenler için eğitim için kullanılan, ama şu anda Shigella için yaygın olarak kabul edilen hiçbir metodoloji var. Tarihsel olarak, SBAs doğru bir şekilde hayatta kalan bakteri ölçmek için çok zaman alan adım gerektiren çok emek yoğun olmuştur. Bu iletişim kuralı basit, sağlam, açıklar ve yüksek üretilen iş tahlil bu önlemler fonksiyonel antikorlar özel Shigella için Serumda tüp bebek. Burada anlatılan yöntem geleneksel SBAs, donmuş bakteriyel stokları dahil olmak üzere birçok avantaj sunar, 96 de tabak, bir mikro-kültür sistemi ve otomatik koloni sayımı tahlil. Tüm bu değişiklikler bu tahlil daha az emek ve daha yüksek üretilen iş yapmak. Bu iletişim kuralı daha basit ve geleneksel SBAs hala basit teknolojileri ve hazır reaktifler kullanarak gerçekleştirmek için daha hızlı. İletişim kuralı birden çok bağımsız laboratuarlarda başarıyla uygulandı ve tahlil sağlam ve tekrarlanabilir. Tahlil önceden klinik hem de klinik çalışmalarda bağışıklık yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir. Shigellacidal antikor titreleri öncesi ve antijen pozlama (ya aşılama ya da enfeksiyon) sonra sağlar nasıl işlevsel antikor yanıt oluşturulan daha geniş bir anlayış ve koruyucu bağışıklık yaptıkları katkı miktarının. Bu standart geliştirme, iyi karakterize tahlil Shigella aşı tasarım büyük ölçüde kolaylaştırabilir.

Introduction

Shigella serotipleri, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a ve S. sonnei, epidemiyolojik yaygınlık genel olarak göstermektedir. İshal hastalığı bu Shigella türleri etkileri askeri, yolcuları1tarafından neden olduğu ve gelişmekte olan ülkelerde25 yaşın altındaki çocuklar arasında ishal ölüm önde gelen nedenidir. Sitemizde şuan Shigellakarşı korumak için lisanslı bir aşı yok, ancak, çeşitli yaşlardaki birden çok aday aşılar vardır. Bu aşılar ve geliştirme, profilaktik diğer çalışmalarında şu anda birçok Shigella lipopolysaccharide (LPS) karşı üretilen antikorlar odaklanmak. LPS çünkü bu büyük bir yüzey antijeni ve Shigella ile doğal enfeksiyon serotip özgü şekilde yeniden enfeksiyona karşı koruyucu olabilir LPS özel antikorlar indükler bir çekici aşı aday olduğunu. Bu nedenle, başarılı bir Shigella aşı olasılıkla multi-valent ve hedef 3- Shigella suşları3,4, genel olarak dolaşan % 70-80 karşı bağışıklık ikna etmek için serotipleri 4 olması gerekir 5 , 6. bu deneyleri Shigella aşı aday değerlendirmek için birden fazla farklı serotipleri için belirli olmasını gerektirir.

Aşı aday değerlendirmek için geçerli immünolojik deneyleri antikor titreleri düzeyde miktarının üzerinde odaklanmak, ama orada fonksiyonel antikorlar değerlendirmek için birkaç iyi karakterize deneyleri. Patojen belirli antikor fonksiyonel mekanizmaları bağlama bakteri yüzey antijenleri ve yapışma için önleme dahil olmak üzere bir dizi yoluyla enfeksiyon mücadele için sorumlu olduğundan antikor fonksiyonel yeteneğini incelenmesi önemlidir ve enfeksiyon bakteri hücreleri veya opsonizasyonla ve fagositoz hedefleme ve doğrudan bağlama ve tamamlayıcı cascade ilk adım patojenleri öldürmek epitel hücrelerinin. Antikorlar hedef bakteri yüzey bileşenleri bağlamak ve birçok zymogens bakteriyel gözenek oluşumu sonucu bu hücre sonuçta harekete geçirmek için önde gelen tamamlayıcı cascade başlatmak bakteriler antikorları tarafından doğrudan öldürülmesi oluşur lizis ve bakteriyel ölüme neden olur. Doğrudan bu bakteriler antikorları ve tamamlayıcı dolaşan tarafından öldürülmesi bir çok önemli savunma hattı erken enfeksiyon sırasında olabilir.

Doğal enfekte bireylerin kendi sera shigellacidal aktivite ile antikor var. Bu Shigella –özel antikorlar geleneksel Kompleman aracılı öldürme kullanarak 7,8deneyleri tespit edildi. Bu bakteri yok edici antikor Shigellakarşı koruma için bir rol olabilir gösterir. Geleneksel bakterisidal deneyleri kendi yürütme basit: serum ısı inaktive (endojen tamamlayıcı faaliyet yok etmek) ve faiz bakteri ile karışık. Eksojen tamamlayıcı bu karisimin belirli bir konsantrasyon eklenir. Reaksiyon karışımı bakteri öldürmek için izin vermek için inkübe ve koloni oluşturan birimler (CFUs) onaylamak için kaplama. Bir kez CFUs sayılır, % 50 öldürme dizin (KI) hesaplanabilir ve bir SBA titresi belirledi. Bu yordamı nispeten basit olmakla birlikte, bu deneyleri emek yoğun ve gerçekleştirmek zaman alıcı olabilir ve sonuçları son derece değişken olabilir. Bu sınırlamaların yanı sıra, hiçbir şey karakterize işlevsel testleri şu anda mevcut Shigella. Bu nedenle, biz başarılı bir şekilde geliştirilen ve Shigella bakterisidal etkinlik üç en klinik suşları9için ölçmek için bir basit, yüksek üretilen iş tahlil nitelikli. Bu iletişim kuralı bir SBA tahlil etkinliği ve tekrarlanabilirlik geliştirmek değişiklikler ile açıklar. Bu değişiklikler ilk donmuş bakteriyel stokları kullanmaktır. Tek Kişilik Kullanım stokları üretimini de tahlil tahlil değişkenlik azaltırken her tahlil kültür taze bakteri için gereksinimini ortadan kaldırır. Başka bir zaman ve emek avantajı bu protokol kurtarmak demek bir 96-şey plaka tahlil biçimi kullanımı. Bu örnekleri seri seyreltme için sağlar, böylece konsantrasyonları bir dizi test edilebilir.  Ayrıca kare Petri yemekler üzerinde örnekleri kaplama için çok kanallı Pipetler kullanımı için sağlar. Bu kare Petri yemekler mikro koloniler üreten bir kültür sistemi ile birlikte kullanıldığında, tahlil için gerekli Ağar kaplamalar sayısı azalır. Bu, orijinal gelişmiş öldürme tahlil (MOPA)10, pnömokok çoğaltılmış opsonophagocytic için serbestçe kullanılabilir koloni sayımı yazılımı ile birlikte, otomatik, hızlı ve güvenilir koloni numaralandırma için sağlar. Tüm bu gelişmeler önemli ölçüde azaltmak uygulamalı tahlil zaman ve birden çok plakalar için aynı anda çalışmasına izin veren bir yüksek üretilen iş sistemi oluşturma.

Bu iletişim kuralı üç SBA burada açıklanan Shigella, en klinik serotipleri için optimize edilmiş iken diğer birçok bakteriyel patojenlere kolayca uygulayabilirsiniz. Bu protokolün potansiyel kullanımı yanı sıra diğer bakteri ile bu iletişim kuralını antikorlar analizini Mukozal örnekleri gibi diğer ilgili örnek türleri ekleyebilirsiniz bir başlangıç materyali olarak sadece serum kullanarak ötesine genişletme potansiyeline sahiptir, tükürük ve dışkı örnekleri de dahil olmak üzere. Aşı sonrası immünolojik yanıt-e doğru araştırmak için bu tahlil kullanımı bağışıklık yanıtı aşı aşılar için rasyonel tasarım lider tarafından oluşturulan daha geniş bilgi verebilir ve nasıl doğal bağışıklık anlamada yardım geliştirir.

Protocol

Bu iletişim kuralı WRAIR insan deneğin koruma kurulu kuralları izler. Bu çalışmada kullanılan insan serum numuneleri WRAIR protokol numarası 1328, insan denekler korunması ilişkin tüm kurumsal ve federal yönetmeliklere uygun olarak bir parçası olarak toplanan örneklerindendir. De-tespit edildi ve bu anonim örnekler kullanımı UAB IRB tarafından (protokol numarası N150115001) insan dışı konu araştırma sınıflandırıldı. 1. hazırlayın tahlil reaktifler % 1 hazırlamak için 100 mL su 1 g jelatin ekleyerek jelatin. Basınçlı kap ve mağaza oda sıcaklığında. 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium klorür) hisse senedi çözüm hazırlamak (1, 000 x) TTC 5 g için 40 mL su ekleyerek. TTC tam olarak çözüldüğünde, 50 ml su ve steril filtre 0.2 µm filtresini kullanarak ses düzeyini ayarlayın. Çözüm 4 ° C’de depolayın ve ışıktan korumak.Not: TTC bakteri kolonileri colorizes ve onları saymak çok daha kolay hale getirir. TTC çözüm bir hafif sarı rengi vardır. TTC çözüm bir kırmızı renk geliştirirse, atmak ve taze hazırlayın. % 10 sodyum azid (NaN3) hisse senedi çözüm (100 x) 5 g NaN3 40 mL su ekleyerek hazırlayın. Tam dağılmasından sonra 50 mL su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.Uyarı: Sodyum azid bir zehir ve hafızanın veya absorbe cilt veya gözlerle aracılığıyla toksik olabilir. Kurşun ve patlayıcı metal azides oluşturmak için bakır tesisat ile tepki. Sodyum azid içeren reaktifler çıkışında azid birikmesini önlemek veya biohazard torbaya atmak için su büyük miktarda ile yıkayın. LBA plaka (LB agar plaka) için 1 litre su ve basınçlı kap LB agar 35 g ekleyerek hazırlayın. 25 mL her kare petri dish (120 x 120 mm2) ekleyin. Tabak RT için 10-20 dk agar kuvvetlendirmek izin vermek için kuluçkaya. Tabakları geri plastik torba ve mağaza 4 ° c ilâ 1 ay için yerleştirin. Overlay Agar agar 7.5 g için 1000 mL su ve basınçlı kap ekleyerek hazırlayın. İhtiyaç kadar 56 ° C su banyosunda kuluçkaya. Şu kullanmadan önce 100 mg/mL TTC ve 10 mL 1 mL ekleyin % 10 NaN3 ve mix iyi.Not: Her LBA plaka yerleşimi Agar 25 mL ihtiyacı var. Bindirme Agar bir ay için önceden hazırlanan ve tahlil için gerektiği gibi bir mikrodalga veya sıcak tabakta erimiş. Agar sıcaklık ~ 55 ° C LBA plakaları uygulamaya önce olduğundan emin olun. Tahlil arabellek su 40 mL 5 mL, 10 x Hanks’ın dengeli tuz çözüm (HBSS) ile Ca2 +/Mg2 + ve 5 mL % 1 jelatin ekleyerek hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. 2. Kompleman hazırlayın ve hedef bakteri Bebeği tavşan tamamlayıcı (BRC) hazırlamakNot: Ayrıntılı ölçütler için tamamlayıcı çok seçim burada bulunabilir: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Donmuş BRC edinin ve soğuk su ile çalışan çözülme. Fiziksel olarak her ~ 10-20 BRC mix tamamen çözdürülen kadar min. BRC tekrarlanan donma çözülme çevrimleri için maruz. BRC çözdürme süre 1,5 mL, 5 mL veya 15 mL santrifüj tüpleri etiketleyin. Tüpler buz önceden soğutmak için etiketli yer. Aliquot uygun BRC birime önceden soğutmalı santrifüj tüpleri (doldurma sonra hemen her tüp buz için geri). Aliquots ≤-70 ° C, dondurucuda saklayın.Not: Yaklaşık 1 m Kompleman her tahlil plaka için gereklidir. Tamamlayıcı aliquots tek kullanım içindir ve birimleri düzenleri tahlil uygun bölünmemeli olmalıdır. Isı inaktive BRC hazırlamak için etkin BRC bir aliquot çözülme. 56 ° C su banyosu hazırlamak. BRC tamamen çözdürülen sonra su banyosu aktarmak için 30 dk kuluçkaya Kuluçka sonra ısı inaktive BRC su banyosundan kaldırmak ve 10-15 dk. Mix şiddetle, RT soğumasını bekleyin ve aliquot ~ 150 µL 1.5 mL microcentrifuge tüpler için. Saklamak aliquots ≤ adlı-10 ° c Hedef bakteri hisse senedi hazırlamakNot: Aşağıdaki yordam hedef bakteri stokunun 48 aliquots hazırlamak için kullanılır; daha fazla aliquots gerekirse protokol ölçeklendirilebilir. Ana stok dondurucudan şişe ve şişe kan agar plaka üzerine küçük bir miktar buz kaldırmak için dondurulmuş bakteriyel yüzey raspa bakteri kaldırın. Hemen ana stok şişe dondurucu için dönmek. Bu küçük aliquot üstüne kan agar plaka ve plaka kapak ile kapak bakteriyel stokunun çizgi. Plaka baş aşağı gecede 37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine kuluçkaya. ~ 10 izole düzgün kolonileri 30 mL LB suyu içeren bir 50 mL tüp aktarın. 3-5 h 37 ° C’de kültür suyu ~0.6-0.7 OD600 kadar nazik sallayarak ile için kuluçkaya. Üst kültür ve taze 50 mL tüp transfer 12,5 mL hasat. 15.000 x g 2 dk bir masa üstü mikro-santrifüj kullanarak için de kültür santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet 25 mL steril gliserol LB-% 15 yeniden askıya alma. Mix iyi ve 0.5 mL aliquots steril 1,5 mL mikro santrifüj tüpler (~ 48 tüpler) içine dağıtmak. Aliquots ≤-70 ° C, dondurucuda saklayın. Aglutinasyon test kullanmadan önce kullanma bakteriyel kimliğini onaylamak. Hedef bakteri hisse senedi için en uygun seyreltme faktörü belirlenmesiNot: Her toplu iş iş hedef bakteri stokunun seyreltme ~ 120 CFU/spot LB plakaları verim için gerekli belirlemek için tahlil koşullarında titre gerekir. Bir microtiter tabak (seyreltme plaka) almak ve 1A iyi tahlil tamponunun 135 µL ekleyin. Tahlil tereyağı 120 µL wells 1B – 1 H için ekleyin. Dondurucudan bir şişe donmuş hedef bakteri kaldırın ve oda sıcaklığında erimek. 15ul 1A 10 kat seyreltme bakteriyel stokunun yapmak iyi çözülmüş bakteriyel stokunun ekleyin. Bakteriyel çözüm 30 µL iyi 1A 5-fold seri seyreltme gerçekleştirmek için iyi 1B aktarın. 1 H 8 dilutions (1:10 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250) toplam için iyi 5-fold seri dilutions devam. Başka bir microtiter tabak (tahlil plaka) almak ve sütun 1 ve 2 tahlil plaka tüm iyi tahlil arabelleği için 20 µL ekleyin. 1 ve 2 tahlil plaka sütun karşılık gelen kuyu içine her sütun 1 seyreltme kalıbının kuyuya 10 µL seyreltilmiş bakteri transfer. Bakterilerin 10 µL seyreltme plaka iyi 1A iyi 1A ve 2A tahlil plaka, vb içine aktarılır. Bir ve Control B, için adımları 3.6-3.12 içinde Serum bakterisidal tahlil (SBA) aşağıda açıklandığı gibi tahlil ile devam edin. Tabakları buza inkübe sonra bir çok kanallı pipet 8 pipet ipuçları ile sütun 1 LBA plaka üzerine kuyulardan 10 µL spot için kullanın. Ayrıca, sütun 2 LBA plaka üzerine kuyulardan nokta. Tahlil ile aşağıda 3.14-4,6 adımlarda açıklandığı gibi devam. ~ 120 CFU/Control B yerinde verimleri bakteri seyreltme belirlemek, bu seyreltme assay olarak kullanılacaktır. 3. serum bakterisidal tahlil (SBA) Not: Aşağıda açıklanan yordamı, bir tahlil plaka için olmakla birlikte, tahlil tabak sayısı arttı. Isı devre dışı bırakabilirsiniz için 30 dk 56 ° C su banyosunda örnekleri örnekleri kuluçka tarafından test.Not: Test örnekleri herhangi bir endojen tamamlayıcı etkinliği iptal etmek için test önce ısı inaktive olması gerekir. Bu tahlil öncesinde yapılabilir ve Inaktif örnekleri yeniden dondurulmuş ya da test kadar 4 ° C de saklı. Bir tahlil plaka almak ve sütunlara 1 den 12’ye, satır A G. Ekle 20 µL aracılığıyla tahlil arabelleği sütun 1 ve 2 satır H / tahlil arabelleği 20 µL eklemek için bkz. Tablo 1. Her test örneği, yinelenen satır H tahlil plaka için 30 µL yükleyin. Örneğin, Örnek 1 30 µL kuyu 3 H ve 4 H dağıtmak ve örnek 2 30 µL dağıtmak wells 5 H ve 6 H, vb. Bir çok kanallı pipet kullanarak test örnekleri 3 kat seri dilutions gerçekleştirin. 10 µ örnek 3 H – 12 H kuyulardan ve karşılık gelen wells aktarmak G satırda kaldır ve örnek de yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix 8 – 10 kez. O zaman 10 µ kuyulardan 3 G – 12 G ve karşılık gelen wells aktarmak F satırda kaldır ve iyice karıştırın. Bu seri dilutions satır A. aracılığıyla devam Satır A wells karıştırma sonra kaldırmak ve böylece bütün wells 20 µl içeren wells 3A-12A üzerinden 10 µl atın.Not: 20 µL serum 80 µL toplam tahlil hacmindeki kullanıldığından, bir 4-fold ek seyreltme tahlil vardır. Bu seyreltme 4 tarafından serum seyreltme çarparak bir SBA titresi hesaplama sırasında dikkate almanız gerekir. Örneğin, 1:2 başlangıç seyreltme kullandıysanız, test edilen gerçek seyreltme 1: 8’dir. Donmuş hedef bakteri stok ve çözülme oda sıcaklığında bir şişe kaldırın. (Bu seyreltme faktörü bölüm 2.3belirlenmiştir) önceden belirlenmiş en uygun seyreltme faktörü göre bakteri tahlil arabellek 20 ml seyreltik. 10 µL seyreltilmiş bakterilerin bir çok kanallı pipet kullanarak tahlil plaka her şey için ekleyin. Donmuş BRC bir şişe ve bir şişe ısı inaktive BRC, tezcan akan soğuk su ile oda sıcaklığında donmuş kaldırmak veya biyolojik bir emanet rendeleyin üzerinde hızlı bir şekilde çözülmesi hava üfleme ile kabine yerleştirin. Isı inaktive BRC % 20 çözeltisi hazırlamak. Mix 100 µL 400 µL tahlil arabelleği ile ısı inaktive BRC. Bu çözümün % 20 ısı inaktive BRC 50 µL sütun 1 (bir kuyu) bütün wells ekleyin.Not: Isı inaktive BRC bir denetim olarak tahlil non-spesifik öldürme (NSK) izlemek için kullanılır. Yerel BRC % 20 çözeltisi hazırlamak. Yerel BRC 1 mL tahlil arabellek 4 mL ile karıştırın. Bu karışımdan 50 µL sütunlar 2 den 12’ye (Control B ve test örnek kuyuları) bütün wells ekleyin.Not: Son BRC tepki karışımı % 12.5 bölgedir. Kısaca tahlil plaka için 10-15 s plaka shaker üzerinde hafifçe sallayarak karıştırmak veya çok kanallı pipet 8 kere kullanarak yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. (Sallayarak olmadan) 37 ° C 2 h için Mikrobiyolojik kuluçka tahlil plaka koymak. Kuru 2 LBA tabak kapakları çıkarmadan ve plakaları yerleştirerek biyolojik Emanet 40-60 dk için kabine içinde karşı karşıya. 2 h kuluçka tamamlandığında, buz ıslak ve reaksiyon durdurmak 10-20 dakikadır kuluçkaya için tahlil plaka taşımak. 12 kanallı pipet kullanarak, kuyu satır H ve spot plaka 10 µL LBA plaka alt üzerine tepki karışımı karıştırın. Hemen plaka eğilme ve lekeler ~1.5-2 cm. tekrarlamak için bu yordamı satır G, F ve E, onları LBA plaka üzerinde önceki satırın üstüne lekelenme için çalıştırmak izin verir. Satır E, F, G ve H bir LBA plaka ve satır A, B, C ve D aynı şekilde ikinci bir LBA tabağa lekeli üzerine benekli, şekil 1bakınız. Çözüm LBA kalıplara (10-15 dk) adsorbe kadar oda sıcaklığında LBA plakaları kuluçkaya. Kapakları LBA Tabaklarda koymak ve LBA plakaları Mikrobiyolojik kuluçka makinesine ters gecede kuluçkaya için yer (~ 16-18 h). S. flexneri 2a ve 3a 29 ° C’de kuluçkaya ve kuluçkaya S. sonnei 26 ° C’de olduğunuNot: Bu sıcaklıklarda daha küçük “mikro-kolonileri” doğru bir koloni sayaç9tarafından sayım için uygun boyutları ile verim. Gecede kuluçka sonra 25 100 µg/mL TTC ve %0,1 NaN3 her LBA plaka içeren mL yerleşimi Agar (~ 55 ° C’de) ekleyin. Hayatta kalan bakteri kırmızı renk geliştirmek, şekil 1 aşağıda görmek izin vermek 2 h 37 ° C’de LBA plakaları kuluçkaya. Plakaları bir dijital kamera ile fotoğraf ve NIST’ın tümleşik koloni numaralandırma yazılım (NICE) yüklendiği bir bilgisayara görüntü aktarmak, bkz: Şekil 2.Not: GÜZEL koloni sayımı bilgisayar yazılımı ücretsiz olarak kullanılabilir. Malzeme listesini bilgi ve yükleme yönergeleri için bkz. 4. sayı bakteri kolonileri Açık güzel bilgisayar yazılımı ve giriş Operatör ismi, deneme bilgi ve herhangi notlar boş alanlara tahlil. Bu veri girildikten sonra bitti düğmesini tıklatın. Aç düğmesini tıklatıp doğru dosyaları bilgisayardan seçerek fotoğraflandı plakaları almak. 4 ve sütun sayısı 12 satır sayısını ayarlayarak tahlil parametrelerini ayarlamak. -3 sigma için arka plan ayarı ve en düşük Çözünürlük ayarlayın. Bkz: Şekil 2. Çıkar bölgeleri (ROIs) tıklayarak ve böylece her yatırım Getirisi doğrudan bir örnek nokta üzerinde sürükleyerek hareket. Tüm bakteri kolonileri örnekleri arasında bir örtüşme ile yatırım Getirisi içinde olduğundan emin olun. Bir tabak tamamlandıktan sonra çift tıklatın saklı veri görüntüleri listesinde sonraki plaka ve ROIs ayarlayın. Bkz: Şekil 2. Tüm plakaları ayarlanmış bulunuyor, yeşil sayısı düğmesini tıklatın, bkz: Şekil 2 ve şekil 3. Sayım bittiğinde.xls/.xlsx biçiminde veri dışa aktarmak için Dışa Aktar düğmesini tıklatın. Adı ve veri analizi için.xls/.xlsx dosyasını kaydedin. Böylece sayar 96-iyi tahlil plaka temsil eden bir tabloda düzenlenir tablo biçiminde dışa veri düzenlemek, bkz: Tablo 2. 5. SBA titresi (KI) ve Non-spesifik öldürme (NSK) hesaplamak Not: SBA titresi veya öldürme dizin (KI) hedef bakteri öldürür serum seyreltme karşılıklı tanımlanır. % 50 CFU aktif Kompleman denetim Wells (Control B) ortalama ve 2 tarafından bölen tarafından dizin (KI) kesme biçimi değerini öldürüyor hesaplayın. Yinelenen içinde çalıştırıldığı her örneğinin her seyreltme için ortalama CFU hesaplamak, Tablo 3′ e bakın. Bir serum seyreltme nadiren tam olarak bu % 50 KI değeri verecektir çünkü iki sıralı serum dilutions, bir o % 50’den az öldürür ve % 50’den fazla öldüren bir hesaplanan, bkz. şekil 4. Enterpolasyonlu SBA KI hesaplama formülü aşağıda gösterilmiştir:Not: Bakteri yok edici titresi veya KI, aynı zamanda otomatik olarak UAB tarafından geliştirilen Opsotiter yazılımı kullanılarak hesaplanabilir. İstek Opsotiter için Dr Moon Nahm veya Bay Rob Burton başvurun. Https://www.Vaccine.UAB.edu iletişim bilgileri için bkz. 1 denetim kontrolü A. ortalama tarafından bölünmüş B ortalama eksi alarak NSK değerini hesaplamak

Representative Results

Tipik bir assay olarak kullanılan bir 96-şey plaka düzeni gösterilir Tablo 1. Bu düzen içinde yinelenen aktif Kompleman denetim wells (Control B), ısı inaktive tamamlayıcı kontrol wells (a denetimi) ve beş örnekleri içeriyor. Örnekleri 3-fold seyreltilmiş seri olarak yukarı satır bir kez test edilecek bir her örnek 8 dilutions için izin kürek çekmek H plaka. Şekil 1 gecede kuluçka ve yerleşimi eklenmesinden sonra iki LBA tabak gösterir. Renk geliştirme yerini almıştır ve tüm kalan kolonileri kırmızı renkte görünür. Bakteri öldürme ilk üç dilutions (satır F-H) test tüm örnekleri için açıkça görülüyor ve örnekleri seyreltilmiş tabak daha da, serum daha az konsantre nerede bakteri öldürme bir azalma görülüyor. GÜZEL bilgisayar yazılımı arabirimi Şekil 2′ de görülebilir. Mikro-koloni sayıları dan güzel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak seen şekil 3′ te ve bu sayıları Tablo 2′ ye organize edilmiştir. Her seyreltme her örneği için ortalama CFU sayısı hesaplanır ve Tablo 3′ te % 50 KI değeri hesaplanır. Bu % 50 KI değer SBA KI şekil 4′ te açıklanan formülüne göre hesaplamak için gerekli değerleri belirlemek için ortalama CFUs her serum seyreltme için uygulanabilir. Tahlil sonucu Tablo 4′ te gösterilmiştir. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontrol A Denetim B Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 Seyreltme 8 B Kontrol A Denetim B Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 Seyreltme 7 C Kontrol A Denetim B Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 Seyreltme 6 D Kontrol A Denetim B Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 Seyreltme 5 E Kontrol A Denetim B Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 Seyreltme 4 F Kontrol A Denetim B Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 Seyreltme 3 G Kontrol A Denetim B Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 Seyreltme 2 H Kontrol A Denetim B Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Seyreltme 1 Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3 Örnek 4 Örnek 5 Tablo 1: tahlil plaka düzen. Sütun 1 ve 2 tamamlayıcı kontrol wells içerir. Bir sütunu 1 bulunur ve ısı inaktive tamamlayıcı kontrol, SBA arabellek, bakteri ve ısı inaktive tamamlayıcı içeren. Denetim B sütun 2 bulunur ve etkin tamamlayıcı kontrol, SBA arabellek, bakteri ve tamamlayıcı içeren. Sütun 3-12 serum örnekleri içerir. Her örnek H satırdan satıra A yinelenen ve 3-fold seri olarak seyreltilmiş çalıştırılır Şekil 1: LBA plakaları renk geliştirme sonra. Temsilcisi S. flexneri 3a bakteriyel mikro koloniler gecede uygun boyuta büyümüş. Bindirme agar eklendi ve kolonileri kırmızı bir renk azaltma TTC bahçedeki bindirme agar tarafından geliştirdik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: NIST’ın tümleşik koloni numaralayıcı (NICE) yazılım arayüzü. GÜZEL bilgisayar yazılımı arabirimi grafik gösterimi. Faiz (ROIs) bölgelerinde sayma önce kolonileri her nokta için üzerinde ortalanır. Veriler doğrudan güzel penceresinden verilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: LBA tabaklar içinde sayılan güzel yazılım. Renkli fotoğraf görüntüleri güzel bilgisayar yazılımı yüklenir ve koloni oluşturan birimler (CFUs) otomatik olarak dikkate alınır. Bu resimde iki temsilcisi LBA tabak ile onların koloni sayımı bilgilerini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Seyreltme 8 186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Seyreltme 7 179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Seyreltme 6 193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Seyreltme 5 184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Seyreltme 4 180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1: 72 Seyreltme 3 207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 Seyreltme 2 201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Seyreltme 1 Kontrol A Denetim B Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3 Örnek 4 Örnek 5 Tablo 2: bakteri kolonileri sayar. CFU sayar biçimi excel güzel bilgisayar yazılımı–dan ihraç edilmektedir. Bu bakteriyel tüm yinelenen örnekleri ve denetim wells için sayar gösteren bir tablo içine ayarlanabilir. Kontrol A Denetim B 148 128 131 120 118 1:17496 Seyreltme 8 189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Seyreltme 7 NSK (1-CtrB/CtrA): % 22 140 115 55 73 84 1:1944 Seyreltme 6 % 50 KI (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Seyreltme 5 132 7 1 1 1 1:216 Seyreltme 4 23 3 2 1 0 1: 72 Seyreltme 3 1 2 1 3 1 1:24 Seyreltme 2 0 0 1 1 4 1:8 Seyreltme 1 Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3 Örnek 4 Örnek 5 Tablo 3: % 50 KI kesme biçimi değerini ve yinelenen örnek ortalamaları. % 50 KI kesme biçimi değerini tüm denetim B wells ortalamasını alarak ve 2 tarafından bölünerek hesaplanır. Ortalamalar yinelenenler yinelenen içinde çalıştırıldığı her örneğinin her seyreltme için hesaplanır. NSK değeri de hesaplanır. Şekil 4: Doğrusal İlişkilendirme, şematik. Her seyreltme serum test (x ekseni) olduğunu, hayatta kalan bakteri (y ekseni) sayısı (siyah elmas) çizilen ve bireysel Puan ince, kesik çizgili siyah çizgiyle bağlanır. Düz ve kesikli yatay çizgiler öldürme, sırasıyla % 50 ve % 0 gösteriyor. Serum dilutions (seyreltme 5) yukarıda (seyreltme 4) % 50 kâr durumunu mahvediyor bir kırmızı çizgi ile bağlı olan ve bakterisidal titresi (KI) belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. SBA KI Örnek 1 72 Örnek 2 216 Örnek 3 1994 Örnek 4 1994 Örnek 5 648 Tablo 4: gösteren bakteri yok edici titresi (KI) sonuçlar SBA. Son SBA KI değerleri her örnek için belirlenmiştir ve gösterilir. Bu değerler ortalama CFUs, % 50 KI kesme biçimi değerini ve Doğrusal İlişkilendirme formül kullanılarak hesaplanır.

Discussion

Burada açıklanan protokol antikor serum shigellacidal etkinliğini değerlendirmek için işlevsel bir bağışıklık tahlil göstermektedir. Bu iletişim kuralı monoklonal antikorlar S. flexneri 3a için belirli için denetim insan sera önceki Shigella üzerinden birlikte kullanılan9 olduğunu gösterdi tahlil11eğitim aşı. Bu tahlil test serum kaynağı yaygın insan klinik örnek için önceden klinik hayvan örnekleri değişiklik gösterebilir ve serum örneği shigellacidal aktivitesinin aşı ve bireysel yaşadı Etkilenmeler etkilenen. Bazı olan yakından ilgili serotipleri arasında özellikle S. flexneri 2a ve 3a S. flexneri beklenebilir ama küçük olan S. sonnei9ile karşılaştırıldığında bu suşlar görülmüştür. SBA temeli tamamlayıcı cascade antikor-antijen bağlayıcı tarafından aktivasyonu odaklanır. Bu nedenle, işleme BRC reaktif birçok kritik adımları bu protokolü yürütülmesinde yer biridir. BRC kullanılmak üzere bu tahlil NSK seviyesinin düşük, diğer bakteri yok edici deneyleri12,13,–14ve tutarlı performans nedeniyle seçildi.  BRC etkinliği sıcaklık duyarlı olduğunu ve döngüleri en aza indirgemek, BRC Kişilik birime bölünmemeli ve BRC aliquots hızlı bir şekilde tahlil kullanımda hemen önce çözdürülen tezcan dondur emin olmak için uygun önlemler alınmalıdır. Tamamlayıcı etkinlik tutarlılığını bu tahlil tekrarlanabilirlik etkisi olacaktır. Tahlil tekrarlanabilirlik etkileyen başka bir kritik üretim ve seyreltme bakteriyel stoklarının adımdır. Bu tahlil başlamadan önce uygun seyreltme bakteriyel stoklarının tespit olduğunu, olarak tahlil Başarı denetimleri A ve B olan tutarlı üretim bağlı olarak CFU sayar ~ 120 CFU nokta başına ortalama olduğunu önemlidir. Yazılım tarafından sayılabilir noktalar almak için bu da plaka bakteri için kullanılan teknik başarılı bir şekilde yürütüldükten zorunludur. Yeminli ifade bakteriyel çözüm ve noktalar ~ 2-3 çalıştırabilmeniz plakası tilting cm koloniler tarafından güzel bilgisayar yazılımı doğru sayma için doğru boyut ve doğru dağılımının üretmek için önemlidir. Tüm bu adımları mastering doğru tutarlı sonuçlar bu iletişim kuralı tarafından üretildiğini garanti eder

Hatta tüm kritik adımlar yürütüldüğünde de hala değiştirmek veya bu iletişim kuralı ile ilgili sorun giderme gerekli olduğu örnekler olabilir. Değişiklikleri diğer bakteri değerlendirmek için bu protokol optimizasyon mikro koloniler oluşumunu sağlamak için gece LBA plaka inkübasyon sıcaklığı, yapılması gerekebilir. Diğer suşların bakteri veya antikor serum, dışındaki kaynaklarının tamamlayıcı konsantrasyon duruma getirilmesi gerekebilir. NSK değerleri ve KIS denetim sera da tahlil uygun şekilde çalıştığından emin olmak için takip edilmelidir. NSK üzerinde % 70 yükselmesi gereken değil. Denetim sera değil değişir KI fazla ± 2SD demek. Bu iletişim kuralı kullanıldığında başarılı ve tutarlı sonuçlar elde etmek için burada yukarıda özetlenen kritik adımlar özel önem ile açıklanan tüm adımları gerçekleştirmek gerekli olacaktır.

Bu iletişim kuralı Shigella araştırma toplumda önemli bir ihtiyaç doldururken, bu sınırlamaları değil. Bu iletişim kuralı biyolojik materyaller üzerinde kullanır ve bu nedenle, her zaman kontrol edilmesi zor bir değişkenlik olacak. Tamamlayıcı aktivitesinden farklı birçok ve kaynakları değişimler değişkenlik deneyleri için katkıda bulunabilir. Bu etkisini azaltmak için tamamlayıcı uygun şekilde idare ve tamamlayıcı satın almadan önce etkinlik için yeni bir sürü test etmek önemlidir. Ayrıca havuzları tamamlayıcı birçok bilinen aktivite ile homojen bir kaynağı var oluşturmak yararlı olabilir. Bu iletişim kuralı tarafından tasarımı basittir ve does değil istemek herhangi bir özel ekipman ve yazılım numaralandırma otomatik koloni serbestçe kullanılabilir. Bu basitlik bir avantaj olsa da, hemen hemen herhangi bir laboratuvarda kullanılmak üzere bu iletişim kuralı izin vermeden o hala bir gecede kuluçka gerektirir. Son deneyleri çok daha kısa kuluçka gereksinimi olan, ancak özel, hazırlık reaktifler15gerektiren tarif edilmistir. Bu testin başka sınırlama mevcut haliyle bu sadece tek bir bakteriyel tür hemen yanız olmasıdır. Shigella alanında multivalent aşı oluşturmak için bir arzu var ve patojenler çok katmanlı bir şekilde değerlendirebilir immünolojik deneyleri olması büyük bir değer. Bu tahlil gelecekte bunu sağlamak için değiştirilmiş olabilir, ancak mevcut haliyle, bir tek-plex tahlil olduğunu.

Bu tahlil bazı sınırlamalar olsa da, hala varolan veya alternatif yöntemler üzerinde pek çok avantajı vardır. Bu avantajı çok daha az emek ve daha geleneksel SBAs daha yüksek-den geçerek bu yönteminin çalışmasını yapmak birleştirmek birçok iyileştirmeler içerir. Donmuş bakteriyel stokları kullanımı, 96-şey plaka tahlil biçimi, daha büyük kare petri yemekler üzerine kaplama, bırakmak için fotoğraf çekmek ve otomatik koloni sayımı, kolonilerin coloration tüm yardımcı malzemeleri ve bunu tamamlamak için gereken süreyi azaltmak için tahlil. Herhangi bir özel reaktifler veya donanım gerektirmediğinden bu tahlil de diğer yüksek üretilen iş yöntemleri üzerinde avantajları vardır. Açıklanan protokol temel reaktifler ve serbestçe kullanılabilir yazılım, herhangi bir laboratuvar ortamında uygulama için izin ile yapılabilir.

Tüm bu iletişim kuralı sağlar avantajları birçok gelecekte araştırmalarda kullanımı destekler. Tahlil bağışıklık yanıtı muayene aşı ya da doğal bir enfeksiyon sonrasında idealdir. Bu uygulama SBA Shigella aşı araştırma değerli bir araç olmak için izin verir ve zaten nerede bu aşılar için yetenek göstermiştir Shigella biyo-eşlenik aşılar aşı immünojenisite değerlendirmek için kullanılan fonksiyonel antikorlar16üretimi teşvik. Bu iletişim kuralı kapsamlı bir şekilde birden fazla Laboratuvarları tarafından test edilmiş ve güvenilir, tekrarlanabilir sonuçlar9üretmek için göstermiştir. Diğer bakteri yok edici deneyleri17kullanarak aynı örnekleri test edilirken bu iletişim kuralı da benzer sonuçlar üretir. Veri tutarlılığı bu tahlil tarafından oluşturulan ve diğer eski yöntemler ile uyumluluk serum örneklerinde bakterisidal etkinlik doğru bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir araç yapar. Tahlil de kolayca ek örnek türleri değerlendirmek için adapte edilebilir. Serum yetişkin klinik deneylere hazır olsa da, bebekler ve küçük çocuklar üzerinde odaklanan çalışmalarda yeterli serum almak zor olabilir; bir nihai hedef nüfus Shigella aşılar için. Bu çalışmalarda, tam kan düzenli olarak filtre kağıt üzerinde toplanan ve kurutulmuş. SBA kullanarak örnek biçimi bu tip ön başarılı olmuştur. Tam kan ek olarak (örneğin, tükürük, dışkı özleri ve idrar) Mukozal örnekleri da Shigella aşı araştırma alakalı olan bir hedef vardır. Şu anda, bu protokolü üç Shigella en klinik serotipleri için değerlendirilmiştir ama aynı zamanda diğer bakteriyel patojenler yanı sıra ek Shigella spp. için adapte edilebilir. Yapılacak çalışmalar çok katmanlı bir tahlil üretim çoğu aynı özellikleri taşıyıp bu iletişim kuralı tarafından açıklanan tahlil ile ele alınacak. Çoğaltılmış bir tahlil birden çok Shigella serotipleri değerlendirilmesi için aynı anda, daha fazla korunması örnek birimleri ve eller tahlil zamanında izin verir. İş devam bu tahlil laboratuvarları için dünya genelinde aktarmak için vardır. Bu Genel değerlendirme aynı zamanda bakteri ve serum değerlendirmek için bu SBA erişimi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji laboratuvarları sayısını artırarak daha büyük bir araştırma ölçekte tahlil eleme doğru daha fazla veri üretecektir örnekleri farklı endemik konumlardan toplanan. Burada açıklanan tahlil basit ve yüksek işlem hacmi ve immünolojik değerlendirme Shigella alan yanı sıra diğer bakteriyel patojenler değerlendirilmesi için daha geniş uygulamalar geliştirmek için yeteneğine sahiptir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser yolu bir hibe için M.H.N. tarafından finanse edildi Bu çalışma bir kooperatif araştırma ve geliştirme anlaşması Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü ve Birmingham Alabama Üniversitesi arasında yapılmıştır.

Materials

Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).
  2. Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).
  3. Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).
  4. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).
  5. Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).
  6. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).
  7. Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).
  8. Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).
  9. Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3 (3), (2018).
  10. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).
  11. Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).
  12. Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
  13. Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).
  14. Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
  15. Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12 (2), e0172163 (2017).
  16. Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).
  17. Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).

Tags

ShigellaBactericidal AssayHigh-throughputAntibodySerumSerial DilutionsTarget BacteriaComplementBRCPlate ShakerIncubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image