Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Todos los experimentos incluyendo muestras de animales descritas aquí han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y la oficina de estado de baja Sajonia para la protección del cliente y seguridad de alimentos (LAVES). 1. alta presión sustitución de congelación y congelación Diseccionar el tibialis de nervus de un ratón (por ejemplo, C57Bl6N, 12 semanas, mujer)9. Sumerja el tibialis de nervus en una gota de 20% de polivinilpirrolidona (1 g de PVP en 5 mL) en tampón fosfato salino (PBS) y cortar piezas de 2 mm de longitud. Colocarla en un portamuestras metálico (tipo A, 0,2 mm de profundidad) con unas pinzas finas. Añadir otro portador plano (tipo B) cubierto con una capa delgada de hexadecano como una tapa e inserte este conjunto en el cartucho de muestra. Transferir varios C. elegans suspendidos en una gota de 20% albúmina sérica bovina (BSA) en M9 (véase Tabla de materiales) con una pipeta de plástico desechable en el portador de metal (tipo A). A continuación, agregar un segundo operador como tapa en la parte superior (tipo B) y montar el cartucho. Tanto de las muestras, para proceder con lo siguiente: alta presión congelar las Asambleas de portador de muestra uno por uno por la carga en el cartucho de tres piezas en la estación de carga del congelador alta presión. Presione el botón de proceso según instrucciones del fabricante.Nota: Ambos tipos de muestras pueden procesarse juntos la substitución posterior congelación. Coloque las muestras en crioviales de 2 ml de congelados 0,1% de ácido tánico en acetona. Realizar a la transferencia en un baño de nitrógeno líquido sin derramar nitrógeno líquido en los frascos. Transferir los crioviales en un conjunto de10 unidad de congelación automática sustitución a-90 ° C e iniciar el programa.Nota: Las muestras se mantienen a-90 ° C 100 h. ácido tánico antes de osmification se utiliza como mordiente para aumentar la absorción de tetróxido de osmio11. Lavar manualmente las muestras 3 x durante 30 min con 2 mL de acetona a-90 ° C en la unidad de sustitución de congelación. Dejar las muestras en 2 mL 2% de tetróxido de osmio, 0,1% acetato de uranilo en acetona para tinción continua en el automático congelación unidad de sustitución de 7 h a-90 ° C.PRECAUCIÓN: tetróxido de osmio es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, y se debe usar equipo de protección.Nota: La unidad de sustitución de congelación automáticamente eleva la temperatura a-20 ° C a 5 ° C por hora. Las muestras se conservan a-20 ° C por 16 h en la unidad de sustitución de congelación. La temperatura se elevará automáticamente a 4 ° C a 10 ° C por hora. Cambiar la solución de tetróxido de osmio con acetona pura cuando alcanza la temperatura de 4 ° C. Retire los crioviales de la unidad de sustitución de congelación. 2. procesamiento asistida por microondas Nota: Realice los pasos siguientes a temperatura ambiente12 usando una unidad de control de temperatura para mantener la temperatura estable (véase Tabla de materiales). Deje los tapones de los tubos de reacción abierta durante el proceso en el microondas. Tomar los portadores de metal muestra de los crioviales y extraer las muestras de la compañía metal con pinza fina o una aguja, manteniendo las muestras sumergidas en acetona en un recipiente de vidrio de reloj (150 mm). Transferir las muestras en tubos de reacción de 2 mL con pinzas finas o una pipeta y con 1 mL de acetona cuatro veces para 40 s a 250 w.PRECAUCIÓN: Thiocarbohydrazide es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, se debe usar equipo de protección. Mancha de las muestras con 1 mL de thiocarbohydrazide de 1% en acetona durante 14 minutos a 150 W para aumentar el contraste. Para realizar la tinción, pipetear la solución thiocarbohydrazide en el tubo de reacción, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendida) durante 2 min en/2 min apagado, iterando para total 14 min. Iniciar el microondas.Nota: Thiocarbohydrazide reacciona con el tetróxido de osmio que se aplicó durante la sustitución de la congelación. Forma un puente, lo que permite más el tetróxido de osmio que se depositará en el original el tetróxido de osmio sitios13. Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s a 250 w. pipeta de la acetona en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y seleccione 250 W para 40 s. Inicio el microondas. Mancha en 1 mL 2% de tetróxido de osmio en acetona durante 14 minutos a 150 w. pipeta de la solución de tetróxido de osmio en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendido) durante 2 min min on/2 off , iterando para total 14 min. Iniciar el microondas. Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s en 250 W (como hace en el paso 2.5). Infiltrar 1 ml aumento de concentraciones de resina en acetona (véase Tabla de materiales) de 25%, 50%, 75%, 90%, 100% y 100% por 3 min a 250 w. pipeta de la resina en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de energía l de 250 W (con la función de vacío encendido) para 3 minutos iniciar el microondas. 3. mínima resina incrustar8 Sacar el tibialis de nervus y C. elegans el tubo de reacción con un palillo de dientes y un lugar en una pieza de plástico de la película (véase Tabla de materiales). Utilice el palillo suavemente empujando la muestra alrededor de en la película plástica hasta que se detecta no hay resina restante. Utiliza una lámpara halógena para calefacción (véase Tabla de materiales) para que la resina se vuelve menos viscosa y es capaz de quitar más fácilmente. Lugar la lámpara halógena lo suficientemente cerca para calentar la resina (teniendo cuidado de no quemar las manos). Polimerizar las muestras para por lo menos 48 horas a 60 ° C sobre la película de plástico en el horno. 4. preparación para FIB-SEM Cortar las muestras polimerizadas junto con la película plástica con una cuchilla de afeitar en un tamaño apropiado el trozo de SEM y sujete a los talones de SEM utilizando una resina conductora de plata (véase Tabla de materiales). Polimerizarse nuevamente a 60 º C durante al menos 4 horas o durante la noche. Capa catódica las muestras en la SEM del trozo de oro durante 1 min a 35 mA mediante un recubridor sputter (también se puede utilizar platino/paladio; basta con una capa gruesa de 10 nm) y colóquelas dentro de la FIB-SEM. 5. data acquisition en el FIB-SEM Las muestras de la imagen con el detector de electrones secundarios usando el software básico manejo del microscopio (véase Tabla de materiales). La muestra debe ser orientada para que la región de interés (por ejemplo, parte media de los tibialis de nervus o C. elegans) es en el campo de visión.Nota: Para realizar la adquisición de datos, incline la etapa a una posición para que la muestra enfrenta a la viga de ion en un ángulo de 90° en una distancia de trabajo adecuada (5 mm) en el punto supuesto de coincidencia de la viga de ion y electrón. Utilizando nuestro instrumento, esto se logra en una inclinación del escenario del 54° y distancia de trabajo de 5 mm. Para configurar la posición correcta de la muestra, una característica común en una inclinación de 0° mientras que la proyección de imagen del centro con el detector de electrones secundarios. Poco a poco la inclinación a 54° (5°, 20°, 54°), recentrado el mismo objeto moviendo el eje de M. Buscar el punto de coincidencia de una función mientras que la proyección de imagen de centrado con el detector de electrones secundarios en 54°, seguida hacia la función de la posición central en el modo FIB. Realizar este mostrando el punto de mira en el software de SEM para tener una indicación del centro. Entonces mueva primero la función de la muestra seleccionada para el centro de la imagen mediante la función de punto de centro del software SEM. Entonces centro de la característica a lo largo del eje y moviendo el escenario en z. Cualquier desplazamiento final entre FIB y SEM se corrige con el cambio de la viga de SEM. Abra el software avanzado (véase Tabla de materiales) para la grabación de conjuntos de datos 3D y siga el Asistente de software paso a paso. En la región de interés, depósito carbono o platino (400 nm) sobre el ROI utilizando una 3 nA actual permite incluso moler y reducir artefactos inducidos por carga.Nota: Mediante la elaboración de la región de interés para ser molido en la superficie del espécimen con la FIB (anchura, altura, profundidad), el software calcula y superpone los tamaños de las funciones de preparación de muestra diferentes, como las trincheras para fresar o zona para deposición de platino/carbón. También, tenga cuidado de la imagen de la superficie de la muestra con corrientes FIB demasiado alta, ya que esto puede dañar la superficie de la muestra. Una corriente de 50 pA es suficiente para la proyección de imagen. Usa la viga de ion enfocada a una zanja para exponer la región de interés (ROI) utilizando un 15/30 nA actual del molino. Utilice la viga de ion enfocada para pulir corte transversal con un nA 7 actual. Después de terminar la preparación de la muestra, configurar los siguientes parámetros de imagen: FIB Fresadoras parámetros en la pestaña de configuración FIB (FIB fresado corriente); SEM imagen parámetros en la ficha Configuración y la imagen ajuste de parámetros en la pestaña de SEM AutoTune (realizar autofocus y autostigmation cada 60 min, tamaño de pixel de 50 nm, tiempo 3, línea 3 de media). Optimizar esto para cada muestra. Para evitar cualquier deriva térmica haciendo que el bloque de cara a la deriva durante la carrera, salir de la sala durante al menos 2 h antes de iniciar la adquisición. Adquirir el conjunto de datos en un molino continuo y adquirir modo con un 700 pA FIB actual. Uso 1.5 kV (modo analítico, 900 V) detector de ESB con una tensión de red de 400 V para adquirir imágenes con tamaño de píxel de nm 5 utilizando el software avanzado (véase Tabla de materiales) y grosor de corte de 50 nm. Una adquisición de la imagen tiene aproximadamente 1,5 min con un tiempo de permanencia de 6 μs. Iniciar la adquisición de datos. Se adquiere una imagen de la FIB en la molienda actual para asegurar que la muestra no se movió y se selecciona la región derecha de interés. Ajustar si es necesario. 6. visualización de datos Abrir imágenes en Fiji arrastrando la carpeta que contiene todas las imágenes en Fiji y seleccione Pila Virtual. Cultivos de la región de interés utilizando la herramienta Rectángulo (imagen > cultivos). Invertir los datos para mostrar el contraste de la microscopia electrónica de transmisión tradicional con membranas en oscuridad (Editar > invertir). Utilice TrackEM214 (Fiji15) para la alineación. Cargar los datos en TrackEM2 (archivo > Nuevo > TrackEM2) haciendo clic en el capa. Después de todas las imágenes se cargan, alinearlos mediante función de mosaico de múltiples capas (haga clic en imagen > alinear > alinear varias capas mosaico). Después de la alineación, las imágenes se exportan como archivos tiff individuales (haga clic en imagen > exportación > imagen plana marca). Seleccione todas las imágenes que deben ser exportadas y eligen Guardar archivo. Para procesamiento posterior, utilizar un desenfoque gaussiano (proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano; sigma 2) y aumento del contraste local (proceso > mejorar el contraste Local; CLAHE: tamaño de bloque 127, cubos de histograma 256, pendiente máxima 1.5), que se aplican en Fiji para suavizar la imagen y obtener una mejor relación señal a ruido. IMOD16 se utiliza para realizar una segmentación manual y visualizar la estructura de interés en 3D. Abra el conjunto de datos en IMOD y seleccione herramientas de dibujo (especial > herramientas de dibujo) para realizar la segmentación manual. Diferentes herramientas manual pueden utilizarse para seguir la estructura de interés en todo el volumen (por ejemplo unir, Sculpt). Usar navegador de imágenes de microscopía (MIB17) para segmentación semiautomática.