Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

Remarque : Il est important d’empêcher le sommeil circulation des feuilles vivantes des échantillons en time-lapse imagerie. Pour minimiser les contraintes mécaniques sur les feuilles, fixation douce des feuilles est nécessaire. Les échantillons de feuilles bien préparés uniquement produisent des images time-lapse adaptés aux diverses analyses d’image. Un protocole utilisant des plantes Arabidopsis transgéniques exprimant YFP-NLS fusion sous le contrôle du promoteur du gène PR1 (plantes pPR1-YFP-NLS) et Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 souche (avrRpt2) (Pst_a2) est décrit ci-dessous, à titre d’exemple. 1. préparation de plantes et pathogènes Remplir un germoir en plastique cellulaire (Table des matières) avec sol autoclavé. Semer une graine de Arabidopsis transgénique par cellule (Figure 1A). Le plateau de transfert à une chambre de croissance maintenue à 23 ° C et cultiver les plantes sous une lumière blanche continue pendant 2-3 semaines. Deux jours avant l’inoculation de l’agent pathogène, ensemencer Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 avrRpt2 (Pst_a2) de la souche provenant d’un stock de glycérol sur NYG moyen (peptone de 5 g/L, extrait de levure 3 g/L, glycérol 20 mL/L, agar bactériologique de 15 g/L, pH 7,0) contenant 100 mg/L rifampicine et 50 mg/L kanamycine et incuber à 28 ° C pendant 48 h. Récolter les cellules bactériennes qui apparaissent sur la surface du milieu à l’aide de pointes en plastique, transférez-les dans un tube en plastique contenant 10 mM MgCl2et remettre en suspension. Mesurer la densité optique (Do) de la solution à 600 nm (OD600). Ajuster la concentration finale de cellules des cellules bactériennes à 108 unités formation de colonies (UFC) / mL, ce qui correspond normalement à OD600 = 0,211. 2. l’inoculation pathogène Découper soigneusement une fiche de cellule contenant une plante âgée de 2-3 semaine sans endommager la plante. La valeur de la cellule dans un germoir de cellule vide (2 x 2 cellules suffisent) pour maintenir un bon équilibre (Figure 1B). Sélectionnez une feuille visiblement saine pour l’inoculation. En règle générale, la troisième, quatrième et cinquième laisse (#3, #4 et #5, respectivement, dans la Figure 1C) du bas de la plante sont faciles à manipuler. Utilisation laisse à la même position dans une série d’expériences pour la meilleure reproductibilité. Eau du sol, tenant la plante avant l’inoculation d’imagerie time-lapse à long terme. Éventuellement, dans le cas d’analyse des promoteurs sensibles aux stress tels que pPR1, pour s’assurer que les plantes ne sont pas naturellement soulignés, examinez les feuilles sous un stéréomicroscope de fluorescence avant l’inoculation de l’agent pathogène afin de vérifier l’absence de signal de la YFP. Exclure les feuilles signal YFP montrant de l’expérience. Porter des gants jetables en latex avant infiltration pour éviter un contact direct avec l’agent pathogène. À l’aide d’une seringue plastique sans aiguille de 1 mL, infiltrer soigneusement le côté abaxial de la feuille avec la suspension bactérienne (108 UFC/mL)11 (Figure 1D). L’inoculation d’une petite portion sur la moitié de la feuille permet une bonne visualisation de l’activité de pPR1 ; la zone infiltrée devient visible en vert plus foncé en couleur par rapport à la feuille restante. Être extrêmement attention à ne pas causer aucun dommage mécanique à la feuille lors de l’infiltration.Remarque : Assurez-vous que tous les espaces intercellulaires, dans la région infiltrée sont complètement remplies (verticalement) avec la suspension de l’agent pathogène ; dans le cas contraire, le domaine PCD sera difficile à visualiser sous le stéréomicroscope fluorescent. Cela peut être simplement confirmé par le parachèvement d’écologisation sombre dans la zone infiltrée. Absorber l’excès d’une suspension bactérienne de la zone qui entoure la section infiltrée de la feuille infiltrée avec une serviette en papier doux. 3. montage de la feuille inoculée Immédiatement après l’inoculation, fixer une lame de verre sur le plateau en plastique à l’aide de ruban chirurgical (Table des matières), telle que la feuille infiltrée se trouve au centre de la lame de verre. Veiller à ce que la lame feuille inoculée est complètement montée à l’intérieur de la lame de verre (Figure 2A). Préparer deux couches de ruban en plastique (dans le cas de bande épaisse de 0,2 mm, voir la Table des matières) et le couper en deux morceaux (Figure 2B; pièces 1 et 2) pour adapter les espaces le long du pétiole de la feuille infiltrée. Organiser la longueur de ces deux pièces, indiqué par une flèche à deux pointes dans la Figure 2B, pour s’adapter à la longueur de la flèche à deux pointes, illustrée à la Figure 2A.Remarque : En découpant un corner de chacune des deux pièces permet d’éviter les dommages au Limbe (Figure 2B, pointes de flèches ; voir également l’étape 3.4 ci-dessous). N’importe quel genre de bande en plastique d’épaisseur similaire est adapté pour la fabrication d’un pont sur le pétiole. La rigidité de la bande en plastique est importante pour une manipulation aisée au cours de la procédure décrite ci-dessous. À l’aide de pinces fines, coller morceaux de bandes 1 et 2 de chaque côté du pétiole tels que les coins coupés de chaque pièce s’aligner sur la base du limbe (Figure 2C). Veiller à ce que les morceaux de ruban adhésif ne pas touchent la lame pétiole ou feuille.Remarque : Ces morceaux de ruban en plastique double couche à la base du limbe agissent comme entretoises et prévenir le stress physique sur le pétiole lors du montage. Préparer un autre morceau de ruban en plastique double couche (Figure 2B, pièce 3) pour adapter la taille de la double-flèche dans la Figure 2B et le coller sur le dessus les morceaux de bandes 1 et 2 pour former un pont sur le pétiole ( Figure 2D, E). Être extrêmement attention à ne pas attraper la lame pétiole et feuilles directement entre les morceaux de ruban adhésif aux positions indiquées par des flèches dans la Figure 2D, E. Doucement de coller un petit morceau de ruban chirurgical (Figure 2F, pièce 4) sur la lame de verre au-dessus de l’extrémité du limbe afin que le limbe est fixé très doucement sur la lame de verre. Seulement appuyer fermement la partie du ruban chirurgical touchant directement la lame de verre (Figure 2F, région décrite avec une ligne rouge en pointillés), pas l’autre partie recouvrant les feuilles. Doucement s’en tenir un autre petit morceau de ruban chirurgical (Figure 2G, pièce 5) à la frontière du pétiole et ruban plastique pièces (1, 2 et 3) afin que le pétiole est fixé très doucement sur la lame de verre et de la bande en plastique pièces. Seulement fixer fermement la partie du ruban chirurgical touchant directement la lame de verre à la lame de verre et des morceaux de ruban en plastique (Figure 2G, zone décrite avec une ligne rouge en pointillés), pas l’autre partie recouvrant le pétiole. Empêcher les feuilles voisines de se déplacer dans le champ de vision du microscope à l’aide de pointes de pipette 200 µL (Figure 2H). Insérer les pointes de pipette dans le sol pour tenir doucement les feuilles voisines de la feuille infiltrée. Veillez à ne pas insérer les pointes trop profondément dans le sol pour éviter d’endommager la racine possible.Remarque : L’usine de prêt est maintenant prêt pour l’imagerie de fluorescence stéréomicroscope. 4. microscopique observation time-lapse Allumez le stéréomicroscope fluorescent.NOTE : Ici, un stéréomicroscope automatique équipé d’un monochrome hautement sensibles de 1,4 millions de pixels appareil photo numérique en mode 12 bits est utilisé (Table des matières). Le microscope doit être placé dans une pièce sombre, équipé d’un système de climatisation ou dans une armoire sombre avec une ventilation suffisante pour maintenir la température de la pièce à 23 ° C en time-lapse imagerie. Mettre les plantes dans l’espace ci-dessus sous l’objectif du stéréomicroscope pour l’imagerie. Définir les paramètres pour l’imagerie time-lapse (voir exemples dans le tableau 1). Assurez-vous que programmation des étapes pour l’exposition à la lumière pendant la période d’intervalle de time-lapse imagerie puisque la lumière a un impact majeur sur les plantes l’immunité12. Utiliser le filtre YFP classique (excitation 500-520 nm ; émission 540-580 nm) pour visualiser le signal de la YFP. Utilisez le filtre de Texas Red (TXR) (excitation 540-580 nm ; longue passe de d’émission 610 nm) pour visualiser la chlorophylle autofluorescence afin que le domaine PCD est visible comme une zone sombre (aucune autofluorescence) entourée par YFP séropositifs cellule couches9 (Figure 3 ( A). Utilisez les paramètres de champ d’epi-lumineuses classiques pour les étapes de l’exposition à la lumière supplémentaire.NOTE : Avant l’expérience, mesurer la puissance de la source lumineuse de l’epi-lumineux et l’ajuster au niveau de la condition de croissance propre usine. Exécutez le programme d’imagerie time-lapse. Pour l’observation à long terme sur plusieurs jours, envisager d’arroser la plante appropriée, par exemple, au cours des étapes de l’exposition à la lumière. Après l’acquisition d’images, omettre les canaux supplémentaires utilisés pour l’exposition à la lumière dans les intervalles (correspondant aux canaux 3-8 dans le tableau 1) de l’ensemble de données. Analyser les données selon différentes méthodes, telles que l’analyse de région d’intérêt (ROI), avec logiciel d’analyse différents d’image tels que Fidji9.