Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları
Summary
Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.
Abstract
Bitki bağışıklık yanıtı bir genom çapında transkripsiyon yeniden programlama ile ilişkili enfeksiyon sitesinde başlatılır. Böylece, bağışıklık yanıtı dağınık şekilde ve geçici düzenlenmiştir. Floresan bir gen bir bağışıklık ile ilgili organizatörü bir otomatik floresans mikroskobu ile birlikte kontrol altında kronolojik zamanmekansal düzenleme bitki bağışıklık, anlamak için basit bir şekilde kullanmaktır. Çeşitli intravital floresan görüntüleme deneyler bir dizi için kullanılan kök dokular aksine, floresan canlı görüntüleme örnekler havadan mikrobiyal enfeksiyonlar bir dizi karşılaşırsanız yaprak dokuları için mevcut. Bu nedenle, zaman uzun süre canlı hücre görüntüleme için Arabidopsis thaliana bitkilerin yaprakları bağlamak için basit bir yöntem geliştirdi. Biz bir savunma ile ilgili marker gen, Pathogenesis-Related 1 (organizatörü kontrolü altında transgenik Arabidopsis bitkiler Sarı floresan protein (YFP) genefused nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) için ifade kullanılan PR1). Pseudomonas syringae pv ile transgenik bir yaprak sızmış. domates DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) ve 40 h bir otomatik floresans stereomicroscope kullanma toplam YFP sinyal içinde vivo hızlandırılmış görüntüleme yapılır. Bu yöntem sadece bitki bağışıklık yanıtı araştırmalar aynı zamanda çeşitli gelişim olaylar ve yaprak dokularda meydana gelen çevre yanıt-e doğru analizler için yararlı olabilir.
Introduction
Bitki bağışıklık yanıtı içeren bir dinamik transkripsiyon birden çok transkripsiyon tarafından düzenlenir yeniden programlama faktörler yanı sıra etki1. Transcriptome veri birikimi bitki bağışıklık sistemi üzerinde bilgi toplamak için fırsatlar sağlar: Örneğin, sinyal ağ yapısı2basamaklandırır. Ancak, kayma ve temporal dinamizm bitki bağışıklık ile ilgili bilgilerimizi hala sınırlı3,4,5kalır.
Önceki çalışmalarda, kronolojik zamanmekansal düzenleme savunma ile ilgili gen ekspresyonu, çoğunlukla In situ hibridizasyon ve β-glucuronidase (GUS) muhabir tahlil6,7,8kullanarak analiz. Bu yöntemler bize ilgi yerinde çeşitli genlerin transkripsiyon etkinleştirme görselleştirmek etkinleştirin. Ancak, bu yordamları örneklerin kimyasal fiksasyonu gerektirir ve böylece tüm geçici bilgi kaybına neden. Biyolojik etkinlikler, bağışıklık, zaman içinde ilerleme gibi. Bir muhabir olarak luciferase kullanımı faiz3organizatörü zamansal dinamiği yakalanması sağlamıştır. Ancak, luciferase tabanlı tahlil pahalı bir substrat ve son derece duyarlı detektörlerle gerektirir. Anlayışımız bitki bağışıklık yanıtı basit bir yordam kullanarak kronolojik zamanmekansal yönlerini artırmak için biz transgenik Arabidopsis thaliana üretilen bitkilerin Sarı floresan protein (YFP) ifade için gen erimiş Nükleer yerelleştirme sinyal (YFP-NLS) savunma ile ilgili marker gen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9organizatörü kontrol altında. Klorofil autofluorescence, canlı hücreler, bir marker kez efektör tetiklemeli bağışıklık (ETI), bir tür bitki bağışıklık belirli patojen bulaşma9 tarafından indüklenen sırasında oluşan programlı hücre ölümü (PCD), işlemi yakalama yapardık , 10. floresans sinyal yoğunluğu içinde serbestçe hareket eden nesneleri, gibi zamansal dinamiği izleme Arabidopsis yaprakları yaşayan, karmaşık bir görüntü işleme yazılımı şirket içinde inşa edilmiş veya mevcut ticari gerektirir. Alternatif olarak, örnek hareket etmesini engelleyen sorunu çözmek için basit bir yöntemdir. Burada, bir otomatik floresans stereomicroscope altında uzun vadeli gözlem altında transgenik Arabidopsis bitkisinin yaprakları yaşayan montaj için çok yönlü ve basit bir yöntem geliştirdi. Yöntemi dynamics olduğu gibi bitki toprak yerli içerisinde bir kaç gün içinde bırakır organizatörü yakalamak için bize sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Arabidopsis yaprak bir organizatörü bir Otomatik floresan stereomicroscope kullanarak uzun vadeli gözlem için ilgi kontrol altında bir floresan muhabir gen ifade bir yaşam bağlamak için basit bir yöntem raporu. Floresan bir gazeteci hızlandırılmış görüntüleme kök dokularda sık gerçekleştirilen; Ancak, yalnızca birkaç benzer çalışmalar içinde yaprak doku yapılmıştır. Bunun en olası nedeni yaprakları ise kökleri genellikle gömülü ve solid agar ortamında sabit uzayda, özgürce hareket edebiliyoruz.
Bu raporda, Pst_a2tarafından indüklenen ETI sırasında pPR1 aktivite kronolojik zamanmekansal dinamikleri üzerinde duruldu. Yukarıda ayrıntılı yaprak yumuşak fiksasyonu ek olarak, açıkça organizatörü harekete geçirmek ve PCD gibi hücresel olayların kronolojik zamanmekansal dynamics görselleştirmek önemlidir. PPR1 etkinliği ve PCD gösteren hücreleri arasındaki ayrım keskin değilse, tüm infiltre alanındaki hücreler arası boşlukları tamamen patojen süspansiyon ile dolu emin olun (bkz. Adım 2.4). Bu örnek aynı dikey konumunu boyunca tüm tespit sinyalleri bu mikroskoplar yakalama beri geniş alanlı floresan stereomicroscopes kullanırken önemlidir. Klorofil autofluorescence hayatta kalan hücreleri üstünde veya altında PCD etki alanı hücrelerde kolayca yok autofluorescence sergilenmesi ölü hücreleri gizliyor. Bu da YFP sinyal için doğrudur.
Hızlandırılmış görüntüleme koşulları dikkatle çeşitli deneysel koşullarda birkaç ön deneyler yoluyla kurulmuş gerek. Hızlandırılmış görüntüleme için parametreleri mikroskobik sistem, transgenik bitkiler ve patojenler. gibi çeşitli etkenlere bağlıdır Bu parametreler elde etmek için biz ilk çeşitli pozlama süreleri YFP sinyal şiddeti, neredeyse pPR1ilk harekete geçirmek ile çakışacak 7 HPI infiltre yaprak için analiz edildi. 5 s pozlama bu çalışmada kullanılan stereomicroscope ile YFP sinyal yakalamak için uygun olarak tespit edilmiştir. Benzer bir sınama klorofil autofluorescence görüntüleme için gerçekleştirildi. Örnek ışığa maruz kalma 3 dk aralıklar arasındaki zaman hata görüntüleme programı maksimum çekim hızı ile normal parlak alan görüntülemede olarak programlandı. Sistemimiz (Tablo reçetesi) yanı sıra YFP, TXR ve parlak alan görüntüleme 2.5 min izin verdi. Bu sınırlama 3 dk aralığı seçmek için başlıca nedeni oldu. Ardından, hızlandırılmış bu durum bitki örnekleri belirgin hiçbir zarar ve ektopik hafif stres kaynaklı harekete geçirmek-in pPR1 (Şekil 3B, C) teşvik değil doğruladı. Bu çalışmada kullanılan programı geliştirilmesi olmuştur. Böylece, floresans görüntüleme 3 dk aralıklarla pPR1 dynamics Pst_a2sırasında yakalamak için yeterli kabul edildi-ETI9aracılı.
Organizatörü-muhabir yapıları, özellikle NLS için yuvarlak floresan reporter ile birçok gruplar ve araştırma toplumdan kolayca kullanılabilir tarafından kullanılan; Kubo vd tarafından yayımlanan yapı kullanılan 13. Eğer uygun transgenik bitkiler elde edilebilir böylece, burada açıklanan protokol yaprak dokuları, inceleyerek herhangi bir bitki biyoloji çalışma odasında kullanılabilir. Bizim basit ve kolay iletişim kuralı kim are içinde meydana gelen herhangi bir biyolojik olay kronolojik zamanmekansal dinamiklerini analiz etmek güçlü araştırmacılar için büyük bir fırsat bırakır, bağışıklık yanıtı gibi sağlar. Teyp parçaları kullanarak bizim Yöntem numuneler üzerinde hafif bir fiziksel stres indükler akla yatkın. Ancak, bu sorun deneyler (Şekil 3C) sahte tedaviler gibi uygun pozitif ve negatif denetimler dahil olmak üzere kontrol edilebilir. Deneysel koşullar daha da değiştirilebilir ve bu denetimlerin farklı koşullar altında analiz ederek en iyi duruma getirilmiş.
Son yıllarda araştırmacılar ilgi biyolojik olayların kronolojik zamanmekansal karmaşık yönleriyle görüntüleme araçları ve teknikleri, hızlı geliştirilmesi teşvik vardır. Herhangi bir görüntüleme analizi, uygun montaj ve tamir örnekleri arasında en önemli sorunlar vardır. Bu çalışmada geliştirilen Arabidopsis bırakır montaj yaşam basit ve çok yönlü yöntemi uygulanan ve çeşitli görüntüleme deneyler için en iyi duruma getirilmiş.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Japonya bilim ve teknoloji ajansı tarafından desteklenmiştir [SB, N.N. ERATOJPMJER1502 için PRESTO117665] ve bilim promosyon (Grants-in-Aid araştırma etkinlik başlangıç [SB 22880008] ve genç bilim adamları (B) [Japonya Derneği tarafından 23780040 SB için]). Biz A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa ve E. Betsuyaku J. Parker Pst_a2 zorlanma ve T. Demura pBGYN vektör sağlamak için sağlamak için mükemmel teknik destek almak için teşekkür ederiz.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
Referencias
- Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
- Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
- Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
- Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
- Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
- Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
- Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
- Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
- Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
- Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
- Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
