ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس
Summary
ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.
Abstract
في السنوات الأخيرة، صدرت مشروع جينوم ل cavefish المكسيكية المكفوفين (مكسيكي أستياناكس)، الكشف عن هويات تسلسل لآلاف جينات. رسملة البحوث السابقة في هذا النظام النموذجي الناشئة على إجراء تحقيقات شاملة على نطاق الجينوم التي حددت عديدة السمات الكمية المكاني (QTL) المرتبطة بشتى تعمل المرتبطة بالكهف. بيد أن القدرة على الاتصال الجينات التي تهم بالأساس الموروثة لتغيير المظهرية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. هو أسلوب واحد يمكن أن تيسر فهم أعمق لدور التنمية في تطور تروجلومورفيك الجامعة-جبل التهجين في الموقع. يمكن تنفيذ هذا الأسلوب مباشرة مقارنة التعبير الجيني بين أشكال الكهف وسطح المسكن، وترشيح الجينات الكامنة أنشئت QTL، تحديد الجينات للفائدة من الدراسات تسلسل الجيل القادم، أو تطوير أخرى النهج القائم على الاكتشاف. وفي هذا التقرير، نقدم بروتوكول بسيط، تدعمها قائمة مرجعية مرنة، يمكن تكييفها على نطاق واسع للاستخدام خارج نظام الدراسة المقدمة. ونأمل أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كمورد واسعة للمجتمع أستياناكس وما بعدها.
Introduction
التهجين في الموقع أسلوب شائع لتلطيخ الأنسجة الثابتة لتصور أنماط التعبير الجيني1. وقد أجريت هذه التقنية للسنوات الأخرى التقليدية2 و غير التقليدية3 نظم نموذجية، لمجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، العديد من الخطوات والكاشفات ضرورية لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. للمحققين الذين أدوا ابدأ هذا الأسلوب، يمكن الشروع في العملية تخويف نظراً للخطوات العديدة التي ينطوي عليها. علاوة على ذلك، طبيعة هذه الإجراءات المطولة يفسح المجال للأخطاء التقنية، التي يمكن أن يكون تحديا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
والهدف العام لهذه المادة هو تقديم أسلوب بسيط ومباشر سوف تجعل هذه التقنية التهجين متاحة لجمهور واسع. للحد من إدخال أخطاء، نقدم نهجاً واضحة غلة تلطيخ التعبير الجيني عالية الجودة ويقلل من الإشارات الخلفية غير محددة. هذا الإجراء مماثل للنهج الأخرى المتقدمة في نظم النموذج التقليدي، مثل دانيو rerio4. هنا، نحن نهدف إلى تسهيل التنفيذ الدقيق لكل خطوة باستخدام قائمة مرجعية لتحميل (تكميلية ملف 1)، النهوض بالتنفيذ الدقيق للبروتوكول. والأساس المنطقي لذلك تيسير المنظمة من خلال العديد من الخطوات المتعلقة بهذا الإجراء. هذا المقال مناسب للباحثين المهتمين في أداء الجامعة-جبل التهجين في الموقع في تطوير الأجنة، ولكن لا إجراء بعد الإجراء. وميزة النهج الذي تم اختياره للباحثين أستياناكس هو أنه قد تم اختبارها وأثبتت في كل من كافيفيش ونقرأ الأسماك السطحية، مما يسهل إجراء تحليلات مقارنة التعبير. طريقة عرض يمكن أن يستخدمها الباحثون في الدراسات أستياناكس وغيرها من النظم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظراً لضعف الجيش الملكي النيبالي للتدهور، إحدى الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول يتعلق بتوليف العقيمة لمسبار الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تحقيق يتم إنشاؤها بعناية، ويقدم نتائج جيدة، فإنه يمكن إعادة استخدامها في ردود المصبوغة لاحقة. خطوة حاسمة ثانية هو إنتاج دقيق لجميع الكواشف …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر الإجمالي لتعليقات مفيدة في هذه المخطوطة. ونود أن نعترف بأربعة من طلاب المدارس الثانوية الذين يستخدم هذا البروتوكول خلال التدريب الصيفي في عام 2017 و 2018، بما في ذلك كريستين تساو وناظر مايكل ولي Aki وديفيد نوانكوو. وأيد HL زمالة “الجذعية البيولوجيا جامعة كاليفورنيا” خلال صيف عام 2017. كان يؤيد هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم (ديب-1457630 إلى JBG)، والمعاهد الوطنية لطب الأسنان والجمجمة البحوث (المعاهد الوطنية للصحة؛ DE025033 إلى JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
Referencias
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
